【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】15H04191 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオセンサー / バイオテクノロジー / 抗体 / 抗原 / 蛍光 / クエンチ / ケミカルバイオロジー / 部位特異的修飾 / 結合タンパク質 / 蛋白質 / 免疫学 / プロテオーム / マイクロアレイ / タンパク質

【研究成果の概要】

従来の免疫測定法には，測定に多数のステップと最低数時間の時間を要する問題があった。我々は最近，組み換え抗体を用いた蛍光免疫センサータンパク質Quenchbody (Q-body)の構築原理を見いだし，サンプルと混合するだけで低分子からタンパク質まで多くの目的物質（抗原）を蛍光検出することに成功した。今回，その動作原理を精査することで，組換え抗体のみならず天然抗体をもQ-body化しうる方法論を複数確立した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】応用ゲノム科学

【研究領域課題番号】17201042 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオーム / マイクロアレイ / 微生物ゲノム / 蛍光ラベル化法 / タンパク質間相互作用 / 遺伝子ネットワーク / マイロクアレイ / バイオインフォマティクス / 大腸菌

【研究成果の概要】

申請者らが独自に開発した「タンパク質C末端ラベル化法」を用いて、大腸菌の全タンパク質約4400を1枚のチップに固定化したプロテオームチップによる大規模なタンパク質問相互作用解析を行うために、(1)プローブとする大腸菌タンパク質のC末端蛍光ラベル化、(2)大腸菌全タンパク質約4400種類を固定化したプロテオームチップの作製、(3)タンパク質問相互作用の検出および解析の各ステップにおいてハイスループットに実験操作を行うための手順を確立した。具体的には、まず、相互作用既知の複数の大腸菌由来タンパク質のペアをモデルとして、スライドガラスへの固定化方法、ブロッキング剤、バッファー組成、蛍光標識タンパク質の濃度などの条件の最適化を行った。さらに、実験データの精度を維持したまま、実験操作をどこまで自動化・簡略化できるかについて検討した結果、高い検出感度と多数スライドの同時処理を可能とする系を構築することができた。そこで実際に、162種類のタンパク質について、96穴マイクロプレート・フォーマットでCy3-dC-ピューロマイシンを含む大腸菌抽出液由来の無細胞翻訳系における蛍光ラベル化を行った結果、145種類(90%)において全長タンパク質のラベル化が確認できた。このうち96種類についてFLAGタグを用いて精製し、DNAマイクロアレイのスポッティング技術を利用して大腸菌全タンパク質4400を高密度に固定化したスライド96枚とそれぞれ反応させたところ、1014の相互作用が得られた。得られた相互作用ネットワークはスケールフリーであったことから、生物学的に有意であることが示唆された。偽陽性の割合を調べるために、いくつかの候補タンパク質を選んでプルダウンアッセイによる検証を行った結果、約50%の相互作用について再現性が得られた。今後、タンパク質C末端ラベル化法とプロテオームチップの組み合わせにより、さまざまな生物種について大規模なタンパク質問相互作用解析を行うことが期待できる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】35,490千円 (直接経費: 27,300千円、間接経費: 8,190千円)

【研究分野】統計科学

【研究領域課題番号】17200020 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

階層ベイズ / 状態空間モデル / グラフィカルモデル / ベイジアンネットワーク / マイクロアレイデータ / 遺伝子ネットワーク / カルバックライブラーカーネル / スペクトル判別 / ゲノム / マイクロアレイ / モデル化 / ソフトコンピューティング / プロテオーム

【研究成果の概要】

一般に生物学的知識は,データベースの形に具現化されることが多い.データベースに登録された情報にも信頼度の属性を与え,つまりそれを確率変数として取り扱うことで,データベースの登録上の過誤やその情報の不確実さをモデル化し,今までのモデルをさらに階層化したベイズモデルを構成した.これにより,マイクロアレイデータからの情報抽出,既存の生物学的知識の有効活用,データベースの信頼性の検証などを統一的に可能にする枠組みを構築した.

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2008

【配分額】46,800千円 (直接経費: 36,000千円、間接経費: 10,800千円)

【研究分野】統計科学

【研究領域課題番号】16300088 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

機械学習 / 統計推論 / ブースティング / 遺伝子発現 / タンパク発現 / SNP / プロテオーム / ゲノムデータ / マイクロアレイ / パタン認識 / メタアナライシス / 関数データ解析 / 独立成分分析 / 自己組織化主成分 / 多重比較 / 一塩基多型 / バイオインフォマティクス / バイアスモデル

【研究成果の概要】

バイオインフォマティックスのための新たな統計科学を構築することに貢献した。特にヒトゲノム多様性に由来する様々なデータから合理的な結論を得るための統計的方法論を開発した。具体的な問題としては、遺伝子発現データからの難治性がん疾患遺伝子の発見や、SNPsデータから薬剤感受性を規定する遺伝子多型の同定が挙げられる。これらの目的のために特化した新たな統計的方法を開発,又は開発中である。主な研究成果は次のようにまとめられる.
1.遺伝子発現の表現形との相関研究はグループ・ブースとの提案,実用化が成された.
2.タンパク発現の相関研究は共通ピーク法が実用化され,実データで新たな知見が得られた.
3.ゲノム多様性と治療効果に関連するSNPsの探索は現在,方法論的検討を終えて進行中である.
4.機械学習の方法論として,ゲノムデータの解析を念頭においてブースティングやICAの統計的考察が統一的に成された.
このことによって機械学習の分野で文字・音声・画像認識のために開発された統計的パタン識別の方法,独立線分解析,ブリーフプロパゲイションが、ゲノムデータの解析法に拡張させたことによって更なる方法の提案と普及が期待される。これは統計学、情報学、人工知能分野などを横断的に展開する新分野の誕生への貢献が期待される。一方で今回の研究プロジニクトよって、厳しい管理とよく整理された環境のもとで,ヒト遺伝子解析データの本格的な統計解析が実施されたことは、従来の多くの困難な問題の解決に多大な貢献が期待される。将来的にはいわゆる「テイラーメイド医療」の実現に、統計学の分野からの積極的な貢献となると考えられる。上記の計画を円滑に進めるために癌研究所,国立遺伝研究,国立がんセンター研究所,国立循環器センター研究所の共同研究者との情報交換,共同研究を密接に行った.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2007

【配分額】14,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】13559007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオミクス / プロテオーム / マイクロアレイ / プロテインチップ / 蛍光ラベル / 相互作用 / ピューロマイシン

【研究成果の概要】

本研究は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という手順で行う。前年度は,これら各ステップについての基盤技術を,Fos-Junをモデルタンパク質としてほぼ確立できたので,本年度は,ラベル化およびマイクロアレイ化のハイスループット化を図るために,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行った.
まず,ポリコーム遺伝子群の中からRYBPおよびRipg1A,カルモジュリン結合タンパク質の中からミオシン軽鎖キナーゼ,カルシニューリン,カルスペルミンなどの遺伝子をクローニングし,GST融合タンパク質として小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成系で同時に平行してタンパク質を合成し,グルタチオンを塗布したスライドガラスに固定化した.この上に,蛍光色素Cy3とピューロマイシンが連結した化合物でC末端標識したRYBP, Ring1Aおよびカルモジュリンを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.このとき,様々な条件検討の結果,固定化するタンパク質の量は0.1mg/mlの濃度があれば未精製でも十分であり,また,固定化した後1週間経過してもスポットを検出することができたことから,スライドガラス上でタンパク質が安定に保存されることが分かった.
さらに,96穴および384穴マイクロプレートを用いたハイスループット化のモデル実験を行った.ストレプトアビジンにペプチドを付加した融合タンパク質を96穴および384穴マイクロプレートで多数,無細胞転写・翻訳し,ビオチンを塗布したスライドガラス上にスポットした.ペプチドに対する抗体および蛍光標識二次抗体を用いて,各スポットのペプチドを検出することに成功した.今後,ヒト完全長cDNAを用いて,タンパク質マイクロアレイの作成を行う予定である.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)