【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】09557059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分化 / 血管内皮細胞 / 血管平滑筋細胞 / 神経堤細胞 / ウイルスベクター / 遺伝子導入 / エンドセリン / 遺伝治療 / 神経提細胞 / 遺伝子治療

【研究成果の概要】

増田は、神経病原性マウスレトロウイルスPVC-211が他のウイルスに比べてラット血管内皮細胞への遺伝子導入効率が高いこと、また、標的となる内皮細胞を2-デオキシグルコースで前処理し、ヘパリン非存在下でベクターウイルスを接種するとさらに導入効率が上がることを見出した。また、可逆的遺伝子導入が不可能であるというレトロウイルスベクターの問題に対処するため、Cre-loxP相同組換えを利用した2種類の新規レトロウイルスベクターを開発した。一つは、ベクター内構造のCre依存性逆位により導入遺伝子の発現を可逆的に制御する“Flip-Flop"型ベクター、もう一つはLTR内にloxP配列を持ち、Cre依存性に導入遺伝子を除去できる切り出し可能型ベクターである。後者はプロウイルス組込み部位の宿主ゲノムや、ベクターによる挿入変異の影響の解析にも有用である。
栗原らは、マウス胚由来の初代培養神経堤細胞から血管平滑筋細胞への分化をex vivoで誘導しうる系を確立した。また、この培養系を利用して、平滑筋細胞コロニー形成がエンドセリン(ET-1)に依存すること、FGF-2は平滑筋分化を抑制し、BMP-2およびBMP-4による分化促進効果とは対照的であることなどを明らかにした。さらに、ET-1ノックアウトマウスの解析から、ET-1がbHLH型DNA結合蛋白であるdHANDの発現維持を介して血管系発生分化の制御に関与している可能性を示した。
以上2カ年の研究により(1)心血管系平滑筋幹細胞の初代培養・分化誘導系の確立と解析、(2)心血管系細胞への可逆的遺伝子導入用ベクター系の開発を達成した。今後はこれらの成果を応用し血管平滑筋細胞への分化能を保持した株化細胞を樹立し、心血系疾患の遺伝子治療動物モデルを作成していく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】11,800千円 (直接経費: 11,800千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】08457202 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エンドセリン / ジーンターゲティング / 血管形成 / 血管リモデリング / トランスジェニックマウス / 遺伝子導入 / 組織特異性 / 遺伝子治療

【研究成果の概要】

血管形成・リモデリング機構の解明のため、本研究ではまず、血管系特異的な遺伝子発現系の確立を目的とし、エンドセリン-1(ET-1)遺伝子プロモーター領域を用いた血管壁選択的遺伝子発現トランスジェニックマウスを作成した。
1.エンドセリン-1(ET-1),アドレノメデュリン(AM)過剰発現マウス:ET-1過剰発現マウスの組織・血中ET-1濃度は野生型マウスの2〜4倍で、低体重と体毛の減少を認めたが、無麻酔無拘束下またはウレタン麻酔下での観血的動脈圧は野生型に比べ差はなく、生理的にみられる程度のET-1の産生増加は、慢性期では血圧レベルに影響しないと考えられた。AM過剰発現マウスのうち1系統は、大動脈AM濃度は野生型マウスの約10倍であった。
2.血管系選択的コンディショナル遺伝子発現マウス:テトラサイクリン反応性オペレーター遺伝子配列(tetO)にレポーター遺伝子(LacZ)を結合したコンストラクト(A)、ET-1プロモーター領域9.2kbにテトラサイクリンプレッサー蛋白(tetR)とVP16C末転写活性化領域の融合蛋白を結合したコンストラクト(B)をそれぞれ作成し、A・Bそれぞれより各々複数のラインを得た。tetOによるLacZ発現をin vitroで確認した後、現在それぞれの系の交配を進め、両方のコンストラクトが組み込まれたマウスの樹立行っている。
以上から、この血管壁遺伝子発現系による遺伝子発現は生理的産生量に匹敵もしくは凌駕するレベルを示し、血管系における遺伝子機能解析への高い応用性が示された。さらに、コンディショナル遺伝子発現系の応用により、血管系でのテトラサイクリンによるON-OFFの調節が期待される。現在、ウイルス系ベクターを用いた遺伝子導入へ向けての準備を進めている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)