【研究領域課題番号】18K09370 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

内耳障害 / アポトーシス / ネクローシス / ネクロプトーシス / アミノ配糖体 / 有毛細胞 / 蝸牛 / 内耳 / 難聴

【研究成果の概要】

細胞死は、分子によって制御された細胞死であるアポトーシスと、それ以外の受動的な細胞死であるネクローシスとにこれまで分類されてきたが、近年の研究により、ネクローシスの中にも、分子によって制御されるネクロプトーシスが存在することが明らかにされた。
本研究では、マウスより摘出した、蝸牛の器官培養を用いて、耳毒性物質ゲンタマイシン（GM）によって誘導される有毛細胞障害について、アポトーシス、ネクローシス、ネクロプトーシスの関与について解析を行った。GMによる内耳障害には、アポトーシス、ネクローシス、ネクロプトーシスのいずれもが関与し、それぞれの阻害薬で内耳障害の軽減がみられた。

【研究の社会的意義】

感音性難聴や末梢前庭障害等の内耳疾患は頻度の高い身体障害であるにもかかわらず、その根本的な治療は未だ確立されていない。薬剤性内耳障害や騒音性難聴、老人性難聴においては、それらの発症に有毛細胞内の酸化ストレスに起因するアポトーシスが深く関与することが示されている。しかしながら、これらの障害に対する抗酸化剤やアポトーシス阻害薬の効果は部分的であり、非アポトーシス細胞死の関与が予想される。
本研究では、耳毒性薬物による内耳障害には、アポトーシスのみならず、ネクローシスやネクロプトーシスも関与することを明らかにした。この研究成果は、内耳障害に対する新規治療の開発に貢献するものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】23791880 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ウロキナーゼ / アポトーシス / MAPK / 内耳有毛細胞 / らせん神経節細胞 / 内耳障害 / 有毛細胞 / らせん神経節 / Ｐ３８ / アミノ配糖体 / ＭＡＰＫ

【研究成果の概要】

ウロキナーゼは血栓溶解薬として臨床応用されている薬剤であるが、近年その抗アポトーシス効果が報告されるようになってきた。今回我々は、ウロキナーゼの内耳アポトーシス予防効果を検討した。内耳有毛細胞培養系にてアミノ配糖体によるアポトーシスをウロキナーゼが予防することを示した。同時にウロキナーゼ投与がアポトーシス経路のP38を活性化することを示しメカニズムの一部を示した。らせん神経節培養系を用い、グルタミン酸投与によるアポトーシスも抑制することも証明した。以上の結果は今後の内耳治療の一つの選択肢として期待できると考える。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】21791597 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 人工内耳 / ウロキナーゼ / タンパク治療 / アミノ配糖体 / 有毛細胞 / 内耳 / PTD-FNK / 蛋白治療

【研究成果の概要】

ウロキナーゼ(uPA)およびそのレセプター(uPAR)作用・PTD-FNKのアポトーシス抑制作用に着目した。モルモットにおいて蝸牛有毛細胞・らせん神経節などにウロキナーゼ受容体が発現していることを証明した。この結果から蝸牛有毛細胞においてもウロキナーゼがアポトーシス抑制に関与する可能性が示唆された。続いて、ラット培養有毛細胞におけるアポトーシス抑制効果を検討した。その結果ウロキナーゼは濃度依存的にアミノ配糖体(カナマイシン)による有毛細胞のアポトーシスを予防することが分かった。PTD-FNKについてもCaspase-9の発現が抑制されミトコンドリアを介したアポトーシスを抑制することが分かった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】20591973 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

未成熟ラット / 有毛細胞 / 支持細胞 / 増殖 / アポトーシス / BrdU / 有毛細胞消失 / 蝸牛 / ネオマイシン / 分裂 / 未成熟ラツト / Caspase3 / 27 / 半規管膨大部

【研究成果の概要】

生後7日目のラットでは蝸牛支持細胞領域に抗Caspase 3抗体および抗p27抗体陽性細胞を認め、アポトーシス促進と増殖能の停止が確認できた。生後7日目のラットのコルチ器をネオマイシン1mMまたは酢酸を含有した培養液中に浸漬し、5日間組織培養を行った。感覚細胞傷害後の支持細胞の分裂・増殖の状態を観察するために、培養3日目からはBrdU1mg/Lを投与しBrdUの取り込みを観察したが、明らかなBrdU陽性細胞を支持細胞領域に同定することは出来なかった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】17659527 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / 薬剤反応性 / 内耳 / 蝸牛 / 難聴 / 有毛細胞 / アミノ配糖体 / 細胞死 / アポトーシス / 蛋白治療

【研究成果の概要】

細胞死を防御する蛋白質を投与して、内耳障害の予防・治療に応用する蛋白治療を開発した。ミトコンドリアからのチトクロームcの放出を抑えるBcl-XLの三つの水素結合を除去したanti-apoptotic蛋白(FNK)を作成し、これにHIV/Tat蛋白のProtein Transduction Domain(PTD)をくっつけて細胞内に導入できるようにした(FNK-PTD)。まずこの蛋白にmycをtagとして付けたものをモルモットの腹腔内投与し、1-6時間後に断頭し、蝸牛を固定し、パラフィン切片を作成した。その後Myc抗体を用いた免疫染色により蝸牛での発現について検討した。その結果、投与1時間後からこの蛋白は蝸牛内に出現し、3時間後に発現量がピークとなり、6時間後には著明に減少することがわかった。発現部位は、主にコルチ器、ラセン神経節であった。つぎにFNK-PTDが蝸牛有毛細胞の細胞死を予防できるかどうか検討した。カナマイシン((1)200mg/kg、または(2)400mg/kg)およびエタクリン酸((1)40mg/kgまたは(2)50mg/kg)によりモルモットの蝸牛有毛細胞を広範に障害し、この前後にFNK-PTDまたは生食を投与した。1週間後ABRを測定し、断頭後蝸牛を固定し、surface preparationにより残存有毛細胞の数をカウントした。その結果FNK-PTD投与群では(1)および(2)のどちらの障害においても有意にABR閾値の上昇を抑制し、内外有毛細胞ともに有意に細胞死を抑制した。また(2)の条件で障害8時間後にcPARP陽性細胞を調べるとFNK-PTDにより有意に減少していた。この結果はFNK-PTDが蝸牛に発現して、耳毒性薬剤による有毛細胞の細胞死を抑制することを示している。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】11877291 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

培養 / 内耳 / 再生 / 遺伝子治療 / 有毛細胞 / Cochlea / hair cell / apoptosis / GDNF / gene therapy

【研究成果の概要】

成熟モルモットを麻酔・消毒後、滅菌操作で断頭し、側頭骨を摘出、実態顕微鏡下に蝸牛と前庭に分け、CO2インキュベーターに入れて培養した。その後1日-7日間培養し、固定してsurface preparationおよび透過電顕にて観察した。蝸牛においては培養2-3日以内に有毛細胞は死滅し、支持細胞も変性した。ただし、1-2日目の透過電顕の所見ではscar formationが見られ、一部支持細胞表面に有毛のような構造が見られた。前庭では有毛細胞の変性は蝸牛より遅く7日間の培養でも正常に近く保たれた。蝸牛・前庭どちらにおいても神経線維の脱落が培養初期より認められた。はじめはfree radical scavenger等の投与により有毛細胞死の防御を予定していたが、すでに同様の実験での報告がなされたため、この実験系を用いて遺伝子導入が可能か検討した。LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを投与し、その発現を見たところ、蝸牛ではmesothelial cell以外に血管条、ラセン神経節、Deiters cellやpillar cellなどの支持細胞、外有毛細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。前庭では有毛細胞および支持細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。今後は神経賦活因子や再生関連遺伝子を組み込んだベクターの投与を行なう予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】1,800千円 (直接経費: 1,800千円)