【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16390433 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脊髄損傷 / オリゴデンドロサイト / 前駆細胞 / 初代培養 / 分化制御 / 遺伝子導入

【研究成果の概要】

現在、損傷脊髄内で神経再生を阻んでいる主要要素の一つに破壊された局所に形成されるグリア瘢痕が含まれることが知られている。このグリア瘢痕の主成分はアストロサイトと線維芽細胞、さらに細胞外基質である。脊髄とよく比較され、再生能力が旺盛な末梢神経ではこのような瘢痕が形成されず、髄鞘形成細胞であるシュワン細胞が増殖して損傷部を充填し、その中を再生軸索が進んでいくと考えられている。そこで、本研究では脊髄でこのグリア瘢痕形成の問題を解決する方法として、(末梢神経のシュワン細胞に相当する)中枢神経の髄鞘形成細胞オリゴデンドロサイトの増殖を誘導して組織を安定化するアプローチをまず検討した。
まず、ターゲットとなるオリゴデンドロサイトの初代培養系の確立に成功し、in vitroで細胞機能の解析が可能となった。次いでオリゴデンドロサイトが十分な増殖因子存在下で未分化形態を維持し、増殖することに着目した。細胞の機能制御には分化の誘導あるいは未分化の維持をコントロールする必要があるが、これまで細胞増殖と未分化維持とを別個に研究した報告は少ない。我々は増殖因子シグナルの下流に細胞の未分化維持機構があると考え、細胞周期制御因子CyclinD1に着目した。CyclinD1及び、その変異体の機能解析を培養系への遺伝子導入によって行った。その結果、CyclinD1分子は細胞周期とは別経路で未分化維持に寄与していることが明らかとなった。今後、この知見を実験動物の精髄損傷モデルに導入しグリア瘢痕形成への影響を検討する。
さらに他の未分化関連因子を網羅的にスクリーニングするために、確立したオリゴデンドロサイト初代培養系を利用しDNAマイクロアレイによる解析を行った。その結果未分化オリゴデンドロサイト特異的な分子を多数同定することができた。今後個々の分子の機能解析を行っていくこととなる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】13,600千円 (直接経費: 13,600千円)

【研究分野】応用分子細胞生物学

【研究領域課題番号】13356008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

味蕾細胞 / 初代培養 / Caイオン / 遺伝子導入 / 細胞接着 / 基底膜 / ラミニン / インテグリン / 味覚

【研究成果の概要】

初代培養した味蕾細胞の細胞形態と細胞間接着は、培養液の細胞外カルシウムイオンの濃度に依存して大きく変化した。0.5mM以上の高カルシウムイオン濃度条件下では細胞同士が強く結合し、細胞塊を形成した。一方、0.1mM以下の低カルシウムイオン濃度条件下では、細胞は次第に分散し、細長い形をとるようになった。これら2つの細胞状態は、カルシウムイオン特異的、かつ、可逆的であった。この結果から、カルシウムイオンは細胞外において味蕾細胞の形と接着を調節する因子であることが示された。
味蕾細胞が接着している基底膜成分に存在するラミニン・サブユニットを分析した。βおよびγサブユニットに関してRT-PCR法および免疫組織化学的方法で解析した結果、β2サブユニットおよびγ1サブユニットが主要な分子種としてラット有郭乳頭基底膜に存在することがわかった。さらに、ラミニンをリガンドとする受容体として機能している可能性があるインテグリンに関して、そのβサブユニットの発現をRT-PCR法で解析したところ、β1、4、および5の3種類の分子が、味蕾細胞を含む上皮細胞層において発現していることが明らかになった。
本研究で確立した味蕾初代培養細胞にアデノウィルスベクター系を用いて、効率90%以上で外来遺伝子を導入することに成功した。この方法を用いてα1アドレナリン受容体導入細胞の細胞内カルシウムイオン濃度のリガンド(アドレナリン)応答性を観察した。その結果、導入細胞の約50%においてリガンドに応答した細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察された。また、リガンド未添加時において細胞内カルシウムイオン濃度が高い細胞ほど、応答性が高い傾向はあったが、応答性と味細胞マーカーとの存在には余り相関が見られなかった。
今後、味細胞を含む味蕾細胞の解析とその応用を行うために有用な実験系となることが期待される。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】43,940千円 (直接経費: 33,800千円、間接経費: 10,140千円)