Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

アポトーシス / RNA結合蛋白質 / KHドメイン / p53 / TGF-beta / エストロジェン / TPA / splicing / D8 / TGF-b / Bim / 3'-UTR / ノックアウトマウス / PNA

新規PNA結合蛋白質D8がアポトーシスを誘導する活性をもつことを見出しその分子機構を解析した。
1)D8はDNAストレスによるアポトーシズの誘導に重要な役割を果たしていることを見出した。
2)ルシフェラーゼ・アッセイ、クロマチン免疫沈降法によりD8のプロモーターがp53やTGF-betaシグナルにより直接に転写活性化されることを明らかにした。
3)D8がアポトーシスを誘導するためには、RNA結合活性をもつKHドメイン1,2両方が必要であった。
4)Bimの誘導がD8によるアポトーシス誘導に重要であることを明らかにした。
5)D8にエストロジェン受容体が結合し、mRNAのsplicingに関与することを示唆する結果を得た。
6)D8以外に染色体1,18,19に存在するファミリーを同定し、TPAによって発現誘導されることを見出した。

RNA結合蛋白質 / p53 / TGF-β / アポトーシス / Bim / KHドメイン / 標的遺伝子 / ノックアウトマウス / TPA / 発現誘導

p53およびTGF-βによって発現誘導される新規遺伝子D8を見出し、以下の事実を明らかにした。
1)D8をHepG2などの癌細胞に強制発現するとアポトーシスを誘導する。RNAiを用いてD8の発現を抑制するとp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導が阻害される。これらの結果から、D8はp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
2)5FU、アドリアマイシンなどによりゲノムの損傷をうけるとD8の発現が増加すること、これらの薬剤によるアポトーシスにD8が重要な役割をはたしていることを見出した。
3)BH3 onlyファミリーに属すBimがD8のKHドメインに結合することを見出した。RNAiを用いてBimの発現を抑制するとD8によるアポトーシス誘導が阻害されることから、BimはD8によるアポトーシス誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
4)D8はアポトーシスを誘導する活性のあるBimのmRNAを安定化することによりアポトーシスを誘導していると考えられた。
5)D8ノックアウトマウスの作成を進めた。
6)D8と相同性が高くドメイン構造も類似した3種類のタンパク質をコードする遺伝子(D8-2、D8-3およびD8-4)が存在し、D8ファミリーを構成していることを見出した。D8ファミリーの各cDNA全長を単離し全構造を明らかにし、ノックアウトマウスの作製を進めた。

破骨細胞 / アポトーシス / Bim / FADD / 骨吸収 / ユビキチン化

破骨細胞は生体では約2週間でアポトーシスによって細胞死に陥る、きわめて短命な細胞であるという事実である。換言すれば、骨リモデリングとは、破骨細胞によって急速に吸収され、欠損した骨組織を、骨芽細胞が緩やかに充填していく過程であるといえる。したがってリモデリングサイクルのイニシャティブをとり、骨代謝回転を決定しているのは破骨細胞であり、破骨細胞の活性、その生存期間は、生体において極めて厳密に制御されていなければならない。骨粗鬆症に代表される骨代謝疾患においては、正常なリモデリングの破綻、すなわち骨形成と骨吸収のアンバランスが大きな問題であると考えられているが、細胞レベルで主たる原因となるのは、破骨細胞の活性上昇・寿命の延長である。本研究においてわれわれは破骨細胞アポトーシスの分子メカニズムを検討した。その結果proapotptotic Bcl-2ファミリーに属するBH3-only protein Bimが破骨細胞アポトーシスに重要な役割を果たしていることが明らかになった。マクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)は破骨細胞アポトーシスを抑制するサイトカインであるが、破骨細胞をM-CSFで刺激するとBimがユビキチン化をうけ、プロテアソームによって分解される。このとき破骨細胞内のERKの活性化が重要な役割を果たす。今後破骨細胞におけるBimの発現を制御する薬剤を開発することによってまったく新しい骨代謝改善剤の開発がみこまれる。

悪性神経膠腫 / 遺伝子治療 / ハイブリッドベクター / アデノウイルス / レトロウイルス / アデノ随伴ウイルス / HSV-tk / アポトーシス / Bim

悪性神経膠腫をはじめとする脳腫瘍の遺伝子治療に適したベクターの開発を目標として、異種のウイルスのハイブリッドを応用した治療ベクターの開発を推進した。(1)悪性神経膠腫における自殺遺伝子治療の効果を高めるため、細胞内で治療ベクターを産生させるアデノ-レトロハイブリッドの治療効果を検討した。HSV-tk発現レトロウイルスベクターのゲノムを有するハイブリッドウイルスを用い、従来得られたin vitroにおける感染実験の結果を参考にマウス皮下腫瘍モデルにて、レトロウイルスベクターを誘導しGCVを腹腔内投与すると、抗腫瘍効果の増強が確認された。また、腫瘍細胞内の治療ベクターのコピー数が約170倍以上増加し、In situ hybridizationにおいて治療遺伝子の発現がより広範に認められた。また、治療遺伝子の効果を高める工夫として、BH3因子とHSV-tkとの相乗効果を確認した。(2)頭蓋内における遺伝子導入においては、より安全性の高いベクターの開発が将来期待される。このため、炎症反応を起こしにくいAAVベクターの悪性脳腫瘍への応用を検討した。各種の神経膠腫細胞株を用いてeGFPを発現する1-5型のAAVベクターの感染様式を比較した結果、2型での発現が高い群、2および5型での発現が高い群、および5型での発現が高い群の3種類に分類された。E1B55kを欠失し腫瘍において優位にウイルスを増幅させるAAVベクターAAVE1、HSV-tkおよびRepを発現するAAVベクターAAVTRや、Capを発現するアデノウイルスベクターAVCapを構築した。AAVTRを、AAVE1、AVCapと共に神経膠腫細胞に感染させ、腫瘍細胞内でのAAVTRの増幅を確認した。動物モデルにおいて感染条件と副反応を詳細に検討することにより、この技術を応用した治療システムの開発が期待される。

【研究分担者】
田中栄	東京大学	医学部附属病院	講師	(Kakenデータベース)
織田弘美	埼玉医科大学	医学部	教授	(Kakenデータベース)