【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】18890054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インターフェロン / IRF / アポトーシス / p53

【研究成果の概要】

生体防御において免疫系の賦活化は必須であり、また適時の適当な免疫応答が恒常性維持に重要である。IRF(インターフェロン制御因子)ファミリー転写因子はインターフェロン誘導のみならず、種々の免疫反応の誘導にも重要な転写因子であり、その異常によって自己免疫反応を含め、免疫応答の破綻をきたす。IRF-5は病原体関連分子の認識受容体であるToll-like receptor(TLR)の刺激により活性化され、炎症性サイトカインの誘導に重要な転写因子であることを明らかにしたが、TLR下流でのIRF-5活性化機構は不明である。この活性化機構のメカニズムの一端を解き明かすべく検討を進めた。まず、IRF-5遺伝子欠損マクロファージを用いてTLR刺激での誘導遺伝子についてマイクロアレイ解析によって検討したところ、これまで報告した炎症性サイトカインのみならず、その他の誘導遺伝子においても顕著な減弱がみとめられる遺伝子が複数存在することが明らかとなった。さらに興味深いことには、刺激において通常は発現が抑制されるような遺伝子群が、IRF-5遺伝子欠損細胞において、むしろ誘導が増強されていることが見いだされた。これらはプロテアーゼなど代謝に必要な酵素群の遺伝子であった。通常は感染時などに抑制されるべき分子が、逆に誘導されることから、IRF-5は自己を攻撃することに繋がる分子の発現を抑える役割を持っていることが示唆された。最近IRF-5について、自己免疫疾患の一つである全身性ループスエリテマトーデス(SLE)との関連が指摘されており、今後はこのIRF-5の遺伝子誘導の抑制機能にも焦点をあてつつ、研究計画に沿って検討を進めていく予定である。

【研究種目】若手研究(スタートアップ)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】2,420千円 (直接経費: 2,420千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】13358012 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA干渉 / RNAi / siRNA / ヒト / マウス / 有効siRNA配列 / ウェブサイト / off-target / 遺伝子機能破壊 / 哺乳類 / 全ゲノム遺伝子 / RNA干渉法 / Dicer / eIF2C1 / インターフェロン / ヒトゲノム / 哺乳類培養細胞 / ds RNA / SiRNA / ルシフェラーゼ / アポトーシス

【研究成果の概要】

RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シーケンス時代の網羅的遺伝子機能破壊法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの変わりに用いられてきた。
我々は、はじめに、哺乳類におけるsiRNA依存的RNAiに、eIF2C1-4及びDicerが必要であり、これらのタンパク質がeIF2CのPIWIドメインを介して相互作用する事を明らかにした。次いでヒトやマウスの遺伝子機能解明をゲノムワイドで実施する上で問題となるsiRNA法の問題点、即ちランダムに設計したsiRNAのおよそ80%は役にたたないという問題にチャレンジし、それを実際的に克服する方法を見出した。内容の詳細は、発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時にみたしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNAの変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータをも知多解析から、ヒトやマウスのほとんど全ての遺伝子に有効なsiRNAが設計できることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNAの配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能かは異がかのうであることが分かった。良く効くsiRNA配列は、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。off target効果を最小にするコンピュータプログラムをコンピュータ科学の専門家(東京大学大学院新領域研究科・森下真一教授)との共同研究でつくり、最適siRNAを、投入した任意の配列に対してコンピュータで素早く応答するweb site (siDirect)を構築した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】34,710千円 (直接経費: 26,700千円、間接経費: 8,010千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】10556061 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

interferon-γ / サイトカイン / interleukin-12 / ワクシニアウイルス / 組換えウイルス / Neospora caninum / Cryptosporidium parvum / タキゾイト / 寄生原虫 / インターフェロン / アポトーシス / IFN-γ / CHV / NcRS2 / IL-12 / p35 / p40 / IRES / ワクチニアウイルス / p7.5プロモータ / tunicamycin / N-linked糖鎖付加 / イヌヘルペスウイルス / INF-γ / LPS

【研究成果の概要】

1)イヌのinterferon-γ遺伝子をクローニングしてワクシニアウイルスゲノムに組み込んだ組み換えウイルスを構築し、このウイルスに感染した細胞中に生物活性を有するイヌのinterferon-γが発現していることを確認した。
2)細胞性免疫の誘導に重要な役割を果たすと考えられているサイトカイン、イヌinterleukin-12遺伝子をくろ-にんぐしてワクシニアウイルスゲノムに組み込んだ組み換えウイルスを構築し、このウイルスに感染した細胞中に生物活性を有するイヌのinterleukin-12が発現していることを確認した。
3)Neospora caninumタキゾイト表面タンパクNcSAG1及びNcSAG2を発現する組換えワクシニアウイルスを構築した。この組換えウイルスはNeospora caninumマウス感染モデルにおいて防御効果をもつことが明らかになった。防御効果はNcSAG2発現ワクシニアウイルスのほうがNcSAG1発現株より有効であった。
4)Neospora caninumタキゾイト表面タンパクNcSAG2を発現する組換えイヌヘルペスウイルスを構築した。この組換えウイル間接蛍光抗体法により感染細胞中に原虫NcSAG2と同様な構造をもつタンパクが発現されることが明らかになった。この組換え体を接種したイヌにおいて原虫表面抗原と反応する抗体が誘導された。
5)ウシヘルペスウイルス1型ゲノム内にCryptosporidium parvumスポロゾイト表面タンパクp23遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを構築した。これをMDBK細胞に感染させ、Western blotting法にて解析した。原虫が発現するタンパクと同じ23kDaの分子量を持つタンパクの発現が確認された。ウサギに接種するとp23に対する高い抗体価を持つIgGが得られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】12,800千円 (直接経費: 12,800千円)