Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

BHV-1 / PRV / TF7-6 / Th1 / アポトーシス / UsORF8 / D8 / RK13 / semi-permissive / non-permissive / GFP / Th2 / gB / gC / HmLu-1 / IE gene / green fluorescent protein / A31細胞

アルファヘルペス亜科に属するウイルスの宿主特異性は種によって大きな差が見られる。その内でウシを宿主とするウシヘルペスウイルス1型(BHV-1)はin vivoにおいてもin vitroにおいても比較的狭い宿主域を示すが、ブタオーエスキー病ウイルス(PRV)は非常に広い宿主域を有する。本研究においてPRVの糖タンパクgBおよびgCの遺伝子をBHV-1のゲノムに組み込んだ組み換えウイルスBHV-1/TF7-6を構築し、この組み換えウイルスの、BHV-1に対してsemi-permissiveあるいはnon-permissiveである細胞に対しての吸着、侵入能が著しく増大している事をQCPCR法を用いてウイルスDNAを定量することによって明らかにした。更にBHV-1/TF7-6のゲノムにくらげ由来の蛍光タンパクGFP遺伝子を組み込んだBHV-1/TF7-6/GFPを構築し、マウス由来のnon-permissiveであるBalb/c/A31細胞への感染実験を行い、蛍光顕微鏡を用いてGFPタンパクの挙動を追跡した。その結果PRVのgB、gCを発現すると感染細胞内で強い蛍光がみられたがBHV-1のimmediate earlyタンパクは発現していなかった。Balb/cマウスに精製したBHV-1/TF7-6および親ウイルスを接種して免疫反応を調べた結果、誘導されたanti-BHV-1IgG2aとand-BHV-1IgG1の比は前者の方が有意に高い事が明らかになった。これはBHV-1/TF7-6が親ウイルスに比してTh1型の免疫反応を誘導しているものと考えられた。BHV-1のUsORF8タンパクは他のアルファヘルペスウイルスのUs9タンパクの相同タンパクであるが、ウサギ由来のRK13細胞に単独で発現させるとアポトーシスを誘導する事を発見した。そこでBHV-1のUsORF8を発現しない変異株(BHV-1・D8)を作出し、RK13細胞に感染させたところ、野生株に比して細胞障害を起こす程度が低く、野生株感染時に見られる顕著なアポトーシス誘導も観察されなかった。更にBHV-1/D8のRK13における増殖能は野生株に比して高かったが細胞外へ遊離されるmatureウイルス量は低下していた。以上の結果、ORF8タンパクはRK13細胞にアポトーシスを誘導することにより、ウイルス粒子を細胞外へ遊離させる機能を有するのではないかと思われた。

LIF / 心筋梗塞 / プラスミド / 心臓リモデリング / VEGF / GFP / 骨格筋 / 共培養 / アポトーシス / 血管新生 / 骨髄細胞 / 遺伝子治療 / 幹細胞 / 心筋細胞 / 骨格筋細胞 / ANP / GATA / 心不全 / 心筋細胞分化 / BMP / TAK / Smad / ATF-2

leukemia inhibitory factor(LIF)の心臓に対する作用をマウスの心筋梗塞モデルを用いて検討した。心筋梗塞後のマウスの下肢にLIFのプラスミドを筋肉内注射したところ、2日後より血液中のLIF濃度は増加し、その後4週間後まで持続した。心筋梗塞を作成してから2週間後に心臓を評価した。LIFプラスミド注射群(LIF群)ではコントロール群に比べ、心筋梗塞後の心機能の低下や心臓リモデリングは軽減していた。梗塞境界領域での心筋細胞のアポトーシス数もコントロール群に比べLIF群で減少していた。LIF群ではVEGFの発現の亢進と血管内皮細胞の増加が認められたことより、LIFによる血管新生が心筋細胞のアポトーシスを減少させている可能性が示唆された。増殖している細胞の核で発現するKi-67蛋白の抗体で免疫染色をおこなったところ、LIF群では梗塞境界領域でKi-67陽性の心筋細胞が認められた。次にGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を野生型マウスに移植し心筋梗塞を作成して解析をおこなった。LIF群ではコントロール群に比べ2週間後の梗塞境界領域におけるGFP陽性細胞数が増加していた。さらにこのGFP陽性細胞が心筋細胞や血管内皮細胞であることを確認した。今回の研究でウイルスベクターを使わなくとも、プラスミドの筋肉内注射のみで有効な治療効果が得られることも明らかとなった。
骨格筋内に心筋細胞へ分化可能な細胞が存在するか否かを検討するため、GFPを過剰発現するマウスの骨格筋由来細胞を単離し、1)新生仔ラットの心筋細胞と共培養、2)骨格筋由来細胞の単独培養、3)心筋細胞と培養液のみ共有するdouble chamber法による共培養、の3通りの方法で培養した。培養5日後に免疫細胞染色法により心筋特異的トロポニン、ANP、GATA4、cadherin、connexin43の発現を比較検討した。その結果、両者の細胞が互いに接することが可能な共培養下においてのみGFP陽性細胞の一部にトロポニン、ANP、GATA4の発現が認められた。また骨格筋由来細胞と心筋細胞との細胞間接着部位にcadherinとconnexin43の発現が認められた。これらの結果から骨格筋内に心筋細胞に分化可能な細胞が存在することが明らかになった。

N遺伝子 / アポトーシス / 壊死 / タバコモザイクウイルス / 移行タンパク質 / 複製酵素 / GFP / リン酸化 / 細胞骨格

N遺伝子をもつタバコがタバコモザイクウイルスの感染に対して示す、過敏感反応を中心に共同研究を行った。28度以下であると、ウイルスが感染した葉の細胞の周辺に感染後2-3日後に壊死が起こり、ウイルスのそれ以上の広がりが押さえられ、封じ込められる。この反応を引き起こすのはタバコモザイクウイルスの遺伝子産物が複製酵素であること、さらにそのアミノ酸配列の一部の50kDaの断片であることが明らかとなった。また、ObというこのN遺伝子をもつタバコの抵抗性を乗り越えることのできるタバコモザイクウイルスの解析を並行して行い、上記の知見が裏づけられた。このウイルスの複製酵素では壊死は引き起こされないのである。さらに、この複製酵素の部分配列上にアミノ酸置換をひきおこして、N遺伝子をもつタバコで壊死を引き起こすようになったObの変異株を解析した。
タバコモザイクウイルスの移行タンパク質が感染細胞内で合成された後に、リン酸化を受けること、そのアミノ酸残基が37番目のセリンであること、そのセリンを置換させると機能しなくなることなどが明らかとなった。リン酸化をうける能力と、細胞内での時間にそった局在性の変化、細胞内での安定性・寿命が大きく関連していることが示された。
さらに、この過敏感反応が引き起こされる現象の前後での、タバコモザイクウイルスの移行タンパク質の発現、蓄積などを解析することが、ウイルス抵抗性の理解のために非常に重要であることがあきらかとなり、将来的にも共同研究をやることの意義があることが確認された。

【研究分担者】
松本安喜	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
高島康弘	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)
松本芳嗣	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
廣井透雄	東京大学	医学部付属病院	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
KUMAR Dinesh	アメリカ農務省	植物遺伝子発現研究所	主任研究員
BEACHY Roger N.	スクリップス研究所	植物生物学部門	教授
岡田吉美	帝京大学	理工学部	教授	(Kakenデータベース)
BEACHI Roger	スクリップス研究所	植物生物学部門	教授
BEACHY Roger	スクリップス研究所	植物生物学部	部長