【研究領域課題番号】22K06185 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / ヌクレオソーム / ヒストン / 転写 / エピジェネティクス

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2022-04-01 - 2025-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】20K15711 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / cGAS / ヌクレオソーム / 自然免疫 / DNAセンサー / ゲノムDNA

【研究成果の概要】

脊椎動物では、ウイルスなどの外来DNAに対する防衛するため、自然免疫のDNAセンサーcGASを備えている。一方で細胞は、自身の設計図であるゲノムDNAを持つため、cGASは、自身のクロマチンを形成したDNAに対しては不活化しなければならない。本研究では、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームとcGAS複合体の立体構造をクライオ電子顕微鏡解析により決定した。本研究結果によって、ヌクレオソームによるcGAS不活化のメカニズムが解明された。

【研究の社会的意義】

本研究で明らかになったcGASの制御機構は、自己と非自己のDNAの区別という、自然免疫分野における中心的な問に一つの答えを与えるものであると考えられる。また、cGASは、がん、老化、自己免疫疾患などの広範な疾病に関与している。本研究成果は、これらの疾病の発症のメカニズムや、制御法についての重要な知見を与えると期待される。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2020-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】19K23714 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / 非コードRNA / 転写制御 / ヌクレオソーム / エピジェネティクス

【研究成果の概要】

真核生物のゲノムDNAはクロマチン構造を形成して核内に収納されている。本研究では、非コードRNAがクロマチン上の転写を制御する機構の解明を目的とした。そこで、非コードRNAが引き起こすヌクレオソーム構造の変化および非コードRNAによるRNAポリメラーゼIIの転写活性への影響を構造生物学的および生化学的解析を行った。その結果として、非コードRNAがヌクレオソームの安定性を変化させることを明らかにした。また、非コードRNAがヌクレオソーム上での転写活性や転写中のヌクレオソーム構造に影響を及ぼす可能性を見出した。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2019-08-30 - 2021-03-31

【配分額】2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)

【研究領域課題番号】19K21177 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / DEK / 癌 / ヌクレオソーム / エピジェネティクス / クライオ電子顕微鏡 / X線結晶構造解析

【研究成果の概要】

遺伝情報の担体であるゲノムDNAは、クロマチン構造をとって細胞核内に収納されている。クロマチン構成因子であり、がん遺伝子であるDEKは、クロマチン構造に作用することで、転写、スプライシング、DNA修復などの多様な核内プロセスに関与し、クロマチンの恒常性を担保すると考えられている。そこで本研究では、DEKが形成するクロマチン構造を解明することを目的とし、DEK-クロマチン複合体を試験管内において再構成し、構造生物学的、生化学的解析を行った。研究の結果、DEK-クロマチン複合体の立体構造を決定し、DEKによる特徴的なクロマチン構造制御機構が明らかになった。

【研究の社会的意義】

クロマチンは、多様な構造変化を介して転写や、複製、DNA修復などの広範な核内プロセスを制御することで、発生、老化、癌化などの複雑な生命現象を実現する。しかしながら、クロマチンがどのように構造変換されるのかについては未だ不明な点が多い。本研究では、クロマチンに結合するがん遺伝子DEKによるクロマチン制御機構の一端を解明した。本知見は、核内におけるクロマチン制御機構の知識を深化するものであり、多様な核内プロセスが調節されるメカニズムを考える一助となる。また、癌におけるDEKの作用機序と、癌に対する創薬への知見を提供する。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2019-04-01 - 2020-03-31

【配分額】2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)

【研究領域課題番号】19K22245 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

化学合成 / クロマチン / DNA / ヒストン / ペプチド / ヌクレオソーム / エピジェネティクス / ライゲーション / 染色体 / 蛍光標識

【研究成果の概要】

（1）ミニ染色体モデルの化学合成…連結するDNAユニットの合成まで完成した。DNAユニット2種類あり、各々Widom601DNA配列を含めた。ユニットの末端は突出末端になっており、制限酵素に対応した配列を有する。
（2）ミニ染色体モデルに含まれる機能性ヒストンの化学合成…大気中でも安定な有機ルテニウム触媒を用いて、ワンポットで複数のペプチドを連結する方法を開発した。有機ルテニウム触媒は、従来のパラジウム錯体に比べて50倍以上の活性を示した。この有機ルテニウム触媒を用いて、リン酸化、ユビキチン化、シトルリン化、アセチル化などの部位特異的な翻訳後修飾を有するヘテロクロマチン因子を合成した。

【研究の社会的意義】

ミニ染色体モデルを創出する方法を確立することに意義がある。任意の配列を含む染色体構造を人工的に作ることはまだ可能になっていない。この方法が確立できれば、簡便に目的の配列や人工的な機能性修飾を含むミニ染色体モデルを獲得することが可能になり、飛躍的に染色体機能研究が進むと考えられる。また、ミニ染色体モデルを創出することにより、細胞内DNA本来の構造や反応に関わる情報を獲得できるようになる。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2019-06-28 - 2021-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】19K06522 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / ヌクレオソーム / クライオ電子顕微鏡 / 構造生物学

【研究成果の概要】

真核生物のゲノムDNAは、ヌクレオソームを最小単位としたクロマチン構造をとることにより細胞核内に収納されている。クライオ電顕解析は、近年様々な技術革新が行われてきたが、急速凍結試料グリッド作製には、複合体の安定化や凍結条件の最適化など試料ごとに多くの課題が残されている。本研究課題では、クライオ電顕を用いたクロマチン構造解析における急速凍結試料作製の効率化、高品質化のため、クロマチン基盤膜グリッドの作製を目的としている。研究実績として、グリッド上の基盤となるグラフェンシートをグリッドに貼り、ヌクレオソームを吸着させることでグリッド上で濃縮および安定化させることに成功した。

【研究の社会的意義】

本研究課題は、クロマチン基盤膜グリッドを作製することにより、クライオ電子顕微鏡によるクロマチン構造解析の効率化および高品質化を図ることを目的としている。本研究を行った結果、グラフェンシートを貼ったグリッド上で、ヌクレオソームを化学固定することなく粒子の崩壊を防ぎ、クライオ電顕で観察することが可能となった。本研究により、クロマチン基盤膜グリッドの基礎ができたことにより、ヌクレオソームおよび高次クロマチンの構造解析だけでなく、エピゲノム情報を導入したクロマチンやクロマチン結合因子複合体などの構造解析の促進が期待できる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18H03931 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヌクレオソーム / DNA / クロマチン / ヒストン / パラジウム / ルテニウム / ペプチド / タンパク質化学合成 / エピジェネティクス / タンパク質合成 / 遺伝子制御 / 化学合成 / 合成化学 / 1細胞イメージング

【研究成果の概要】

（1）人工ヌクレオソームの化学的製造法の確立…有機金属錯体を用いた新たなペプチドライゲーション法を確立して、コアヒストン4種類（H2A, H2B, H3, H4）およびリンカーヒストンH1の合成を行った。
（2）スーパーヌクレオソームの創出…原子による細胞機能制御の本質を見抜くために、タンパク質修飾法を検討して、天然にはない機能を付与した「スーパーヌクレオソーム」を化学合成する方法を確立した。

【研究の社会的意義】

独自の化学合成の確立を通して、天然にはない標識や反応性官能基、複数の複雑な機能性ユニットをヒストン構造に入れることが可能になるので、機能解明を支援する創造的スーパーヌクレオソームを作成して未知のヌクレオソーム機能を明らかにすることができる。これによって、ヌクレオソーム内DNAへ働きかけることができる新たな抗がん剤設計などに利用することができる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】44,200千円 (直接経費: 34,000千円、間接経費: 10,200千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】15F15729 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リーシュマニア / クロマチン / ヌクレオソーム / ヒストン

【研究成果の概要】

遺伝情報物質であるDNAは、真核生物において、クロマチンを形成して核内に収納されている。クロマチンは、ヒストンタンパク質複合体の周りに約150 bpのDNAが巻きついたヌクレオソームを基本構造単位としている。クロマチンの構造は遺伝子の発現制御に重要な役割を有する。近年、寄生虫を代表例として、宿主細胞への感染にともなって宿主細胞のクロマチン構造に影響を及ぼす病原体が報告されている。本研究では、リーシュマニア寄生虫がヒストンを分泌する事から、リーシュマニア寄生虫のヒストンがヒトの細胞内で作用すると着想した。研究期間中に、ヒト培養細胞を用いた細胞生物学的解析を行い、さらにリーシュマニアヒストンH3（LmaH3）を含むヌクレオソームの生化学的解析、構造解析を行なった。
細胞生物学的解析においては、リーシュマニア寄生虫のLmaH3をヒト細胞で発現させ、LmaH3がヒト細胞の核内に取り込まれること、LmaH3がヒトのゲノムDNA上でヌクレオソームを形成することを示した。ヒト細胞内でのLmaH3のヌクレオソーム形成は、ヒト細胞の遺伝子発現プロファイルに影響すると考えられる。
生化学的解析、立体構造解析においては、大腸菌を用いてリコンビナントタンパク質としてLmaH3を発現・精製し、ヒトのヒストンと複合体を形成させ、LmaH3とヒトのヒストンからなるヘテロタイプのヌクレオソームを試験管内で再構成することに成功した。さらに、X線結晶構造解析により、LmaH3とヒトのヒストンを含むヌクレオソームの立体構造を3.6Aの分解能で決定した。本研究を通して、寄生虫感染の際に宿主クロマチンの構造が変化するメカニズムに対する理解が深まったことは大変な意義がある。本研究を行う間、産休および育児休暇を取得した。これらの事実から、2年間の実働の研究期間において十分な研究成果が得られたと評価する。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2015-04-24 - 2018-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】25291037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

溶液散乱 / 小角散乱 / クロマチン / ヌクレオソーム / セントロメア / 分子動力学計算 / 粗視化モデル

【研究成果の概要】

Ｘ線・中性子溶液散乱解析から、H2A.Bモノ・ヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることを実証し、この性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンが形成できることを示した。また、H3およびH3のバリアント（CENP-A）を含むヌクレオソームが３つ連結した高次ヌクレオソーム複合体（H3-CA-H3トリ・ヌクレオソーム）のＸ線溶液散乱解析からH3-CA-H3トリ・ヌクレオソームが通常のものに比べて開いた構造をしていることを示した。さらに、粗視化モデルを構築してMD-SAXS法による動的解析を行い、H3-CA-H3トリ・ヌクレオソームのセントロメア領域おける機能を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】24570138 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

相同組換え / クロマチン / タンパク質-核酸相互作用 / ヌクレオソーム / ヒストン / 相同的対合

【研究成果の概要】

本研究は、クロマチン上での相同組換えの分子機構を明らかにすることを目的とする。相同組換えは、DNAの二本鎖切断によって開始され、切断部分と相同な配列をゲノム上で検索する。ゲノムはヒストンを始めとするクロマチンを構成するタンパク質によって凝集されているが、その中から、どのようにして相同な塩基配列を見つけ出すのかは不明である。そこで申請者は、ヌクレオソームと相同組換えタンパク質との複合体を構造解析し、クロマチン上での相同検索機構の一端を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)

【研究分野】遺伝・ゲノム動態

【研究領域課題番号】23770008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / ヌクレオソーム / セントロメア / CENP-A / CENP-B / 染色体 / ヒストン / ヒストンシャペロン

【研究成果の概要】

ゲノムDNAは、遺伝情報を担う重要な物質である。細胞の分裂に伴い、ゲノムDNAは正確に継承されなくてはならない。そのため、S期で複製され倍加したゲノムDNAを、2つの娘細胞に均等に分配する機構が存在する。この均等分配機構の詳細は明らかとなっていないが、ゲノムDNA上の領域であるセントロメア領域が重要な役割を果たしている。セントロメア領域のクロマチン構造が、セントロメア領域の機能発現に重要であると考えられている。本研究では、セントロメア領域に形成されるクロマチンの構造の解析を行った。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】21570185 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / 発現制御 / ゲノム / クロマチン / ヌクレオソーム / 転写制御 / DNA構造 / ヒストン / 出芽酵母 / 酵母

【研究成果の概要】

遺伝子発現におけるクロマチン機能に関する重要な問題の一つは、ヌクレオソームの配置決定とそのダイナミクスの機構である。本研究では、転写制御に着目し、出芽酵母ゲノム及びミニ染色体において、ヌクレオソームの配置を規定するシス因子としていくつかのDNAリピート配列を同定した。また、トランス因子としてクロマチンリモデリングIsw2複合体、ヒストン脱アセチル化酵素Rpd3、ピストンH3バリアントの機能を解析した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】21870038 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / セントロメア / ヌクレオソーム / ヒストン / ヒストンバリアント / ゲノム機能 / ゲノム構造

【研究成果の概要】

本研究では、真核生物のセントロメア領域の主要な構成因子であるヒストンH3バリアントCENP-Aを含むヌクレオソームの立体構造を明らかにした。本構造解析によりCENP-Aヌクレオソームは各二分子のヒストンCENP-A、H4、H2AおよびH2Bからなるヒストン八量体にDNAが左巻きに結合していることが明らかとなった。またCENP-Aヌクレオソームでは、ヒストン八量体に安定に結合しているDNA の長さがH3ヌクレオソームと比べ約26塩基対短いことが分かった。この知見より、CENP-Aヌクレオソームが、セントロメア領域に特異的なDNA結合タンパク質のセントロメア領域への集積や、セントロメア領域に特徴的な高次クロマチン構造の形成に関与していることが示唆された。また、CENP-Aのloop1領域のアミノ酸がCENP-Aのセントロメア領域への安定的な局在に重要であることも構造生物学および細胞生物学的解析により明らかにした。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】2,756千円 (直接経費: 2,120千円、間接経費: 636千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】19570169 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / 遺伝子 / 発現制御 / 転写制御 / クロマチン / ヌクレオソーム / ヒストン / 酵母

【研究成果の概要】

真核生物のゲノムDNAはヒストンと結合し、ヌクレオソーム、クロマチンとして核内に収納されている。遺伝子発現におけるクロマチンの機能を明らかにすることを目的として、まず、ヒト由来His_6タグ付ヒストンH3バリアントを酵母で発現させ、それを含む酵母ミニ染色体を容易に精製する系を構築した。さらに、ゲノム遺伝子座におけるヌクレオソーム配置のダイナミックな変化が、転写制御に本質的な機能を有することを示した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】15570147 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / ヌクレオソーム / ベントDNA(bent DNA) / プロモーター / 転写調節 / DNA高次構造 / DNAフレキシビリティー / target-site selection / 機械的特性

【研究成果の概要】

代表的な二つの研究成果について述べる。
(1)真核生物遺伝子のプロモーターデータベースである"EPD(eukaryotic promoter database)"に公開されているヒトのプロモーターのすべて(1871種)を対象として、DNAのフレキシビリティーを解析した。その結果、TATAボックスもイニシエーターも共に上流側が"柔らかい"配列で構成され、下流側は"硬い"配列で構成されていることが判明した。また、同じ特性がマウスのプロモーターでも見られることが明らかになった。さらに、明確なシス配列を持たないプロモーターでは、転写開始点を中心とした数塩基対の領域がTATAボックスやイニシエーターの機械的特性と良く似た特性を有していることが明らかになった。
(2)負の超らせんを擬態した180塩基対の合成ベントDNA(T20)は、一過的遺伝子発現系、エピソーマルアッセイ系、クローン化細胞株を用いたステーブルアッセイ系のすべてでプロモーターを活性化できることが分かった。なお、クローン化細胞株としては、HeLa細胞ゲノムの様々な位置に1コピーのレポーターを組み込んだ6種の細胞株と、これらの株からT20を欠失させた6細胞株を用いた。さらに、エピソーム上またはクローン化細胞株のゲノムDNA上でT20領域に形成されるクロマチン構造を解析したところ、どちらの場合も、この領域には並進位相の異なる様々なヌクレオソームが形成されるが、各ヌクレオソーム上でDNAがとる回転上の位相は、すべて同じであることが判明した。以上から、プロモーター領域に結合したヒストンニアの移動をT20が助けることで転写が活性化する機構が考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】13680770 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / ヌクレオソーム / ベントDNA(bent DNA) / プロモーター / 転写調節 / DNA高次構造

【研究成果の概要】

本研究では、まず、一過的に導入されたレポーター上に細胞核内で形成されるクロマチン構造を解析した。レポーターには、負の超らせんを擬態した176bpの人工ベントDNA(T20)をもつ単純ヘルペスウィルスtkプロモーター、T20をもつヒトhsp70Bプロモーター、ならびに左方向に緩やかにねじれた構造をとったマウスpgk-1プロモーターを用いた。T20は、我々が構築したベントDNAであり、細胞内でtkプロモーターを約100倍も活性化できる。今回、この系においてもプロモーター領域にヌクレオソームが形成されることと、強力なプロモーターとして知られるpgk-1プロモーター上にもヌクレオソームが形成されることが明らかになった。また、予備的ではあるが、hap70Bプロモーターの上流にT20を導入すると、"promoter-proximal pausing"が少し解除されることと、この現象に下流域のクロマチン構造が関与している可能性が示唆された。次に、レポーターをゲノムに1コピーだけ組み込んだ各種のHeLa細胞株を樹立し、解析を行った。その結果、T20をプロモーターの上流にもつ細胞株の場合、ヘテロクロマチン領域内でもプロモーターが活性化していることが明らかになった。
さらに我々は、ヒトのクラスIIプロモーターの中から、177のプロモーターを選定してコンピュータによる高次構造モデリングを行った。その結果、TATAボックスを含む領域には、正または負の超らせんを擬態したベントDMが高頻度に存在するが、転写開始点付近のらせん軸は多くの場合直線的であることが解明された。
以上の結果から、負の超らせんを擬態したベントDNAは、積極的にヌクレオソームを形成することで転写に寄与していることが示唆された。正の超らせんを擬態したベントDNAの場合、ヌクレオソームの形成を阻害して転写に寄与していると予想される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】09680681 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ベントDNA(bent DNA) / プロモーター / 転写制御 / クロマチン / ヌクレオソーム / 転写(真核細胞) / 転写調節 / DNA高次構造

【研究成果の概要】

本研究では、人工合成したベントDNAとヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ(tk)プロモーターまたはヒトアデノウイルス2型E1A遺伝子プロモーターを用いて、50種類にものぼる組換え体を作製し、ベントDNAの形、プロモーターに対する回転上の配向、そしてその存在位置がプロモーターの活性に与える影響について、系統的な解析を行った。その結果、プロモーターを活性化できるベントDNAの形を解明し、加えて、プロモーターに対するベントDNAの最適空間配置も解明した。tkプロモーターの場合、TATAボックスの中心から上流に約140bp離れた位置に、左向きのねじれを持ったベントDNAの中心が存在すると(このとき、両中心は互いにほぼ反対向きの配置になる)プロモーターが最も活性化された。次に転写活性化の分子機構を解明するために、ベントDNAがプロモーター領域の局所的なクロマチン構造に及ぼす影響について解析した。その結果、再構成ヌクレオソームを用いたinvitroの解析でも、また、単離核を用いたin vivoの解析(in vivo DNaselフットプリントアッセイ)でも、高活性プロモーターにおいてのみ、TATAボックス上にヌクレオソームが形成されないことが解明された。これは、ベントDNAが試験管内だけでなく、生細胞核内においてもクロマチン構造の構築に大きな影響を及ぼしたことを示している。一般に、ヒストンは高活性を示すプロモーターには結合しにくくなっていると予想されるが、ベントDNAを持つ高活性プロモーターでは、このような現象が実際に起きることが明らかになった。今回得られた結果は、ベントDNAによる転写調節が、真核細胞ではクロマチン構造の制御を介して行われることを強く示唆するものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)