【研究分野】遺伝・ゲノム動態

【研究領域課題番号】19570008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

クロマチン / ヒストン修飾 / 後生遺伝学 / ストレス応答 / ノンコーディングRNA / エピゲノム / ヒストン / 組換え / 転写 / 減数分裂 / 転写制御 / 染色体 / non-coding RNA / エピジェネティクス

【研究成果の概要】

分裂酵母M26/CRE 配列の周辺におけるヒストン修飾やクロマチン再編成に関わる因子を数種同定し、それらの欠失変異株について、種々のストレスに対する感受性やヒストン修飾における役割を解明した。さらに、グルコース飢餓時に転写が活性化する分裂酵母fbp1+遺伝子座におけるクロマチン再編成に、mRNA 型の長鎖ノンコーディングRNA のカスケード転写が関わることを見出し、ノンコーディングRNA を介した新しい転写活性化モデルを提出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】14580689 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

組換え / 転写制御 / クロマチン / ヒストンアセチル化 / 抗体遺伝子 / 組換え活性化 / 対立遺伝子排除

【研究成果の概要】

ニワトリDT40細胞の抗体遺伝子座における遺伝子組換えの制御機構をクロマチンレベルで解析した。組換え活性の異なる対立遺伝子間での組換え・転写活性の相異に着目し、両対立遺伝子間でクロマチン構造やヒストンアセチル化レベルを比較した。その結果、遺伝子変換の活動度とDNA近接性・ヒストンアセチル化レベルの間に相関を認めた。また、細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤TSAで処理し、抗体遺伝子座における組換えや転写を調べ、TSA処理による遺伝子変換頻度の大幅な上昇を検出した。この現象と磁気ビーズに固定した抗原を用いて、迅速にモノクローナル抗体を作製する手法を開発した(Nature Biotech.2005)。
抗体遺伝子座における組換え活性は、転写活性と相関を示したが、ヒストンアセチル化は活性型・不活性型対立遺伝子双方で昂進しており、ヒストンアセチル化レベルとは相関が見られなかった。そこで、組換えと転写の関係を調べる目的で、誘導可能な転写プロモーターを上流に持つ組換えマーカー遺伝子(テトラサイクリン誘導プロモーター配列を挟む形で配置した不完全な緑色蛍光タンパク質(eGFP)および青色蛍光タンパク質(eCFP)遺伝子、その下流に核マトリックス結合配列と抗体遺伝子座の3'エンハンサー配列を連結したもの)をDT40の染色体に挿入し、ドキシサイクリン非存在下で培養を行った。組換え体検出は、FACSによる蛍光強度測定でより蛍光強度の強いeGFPの蛍光を発する細胞集団の出現頻度を測定して行った。その結果、転写誘導5日後には全く観察されなかったeGFP発現細胞が0.3%程度出現した。これらの細胞の抗体遺伝子DM配列から相同組換えの誘導的活性化を確認し、ニワトリ抗体遺伝子座などの相同組換え活性化には転写活性化が重要であることを見出した。この系は新機能遺伝子の創製に応用可能である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】11680712 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

組換え / ホットスポット / ストレス応答MAPキナーゼ / cAMP依存性キナーゼ / 減数分裂 / 分裂酵母 / クロマチン再編成 / ヒストンアセチル化 / 染色体 / クロマチン / ヒストン / 転写 / cAMP / MAPキナーゼ

【研究成果の概要】

真核生物の減数分裂期組換えは、ホットスポットと呼ばれる特定の染色体部位DNA二本鎖切断が契機となって開始される。これまでに我々は、出芽酵母や分裂酵母を用いて、組換えホットスポットが染色体上で特異な「開いた」クロマチン構造を取る事を明らかにしてきた。
本研究計画では、ade6-M26点突然変異によってもたらされる分裂酵母の減数分裂期組換えホットスポットに関して、クロマチン構造と組換え開始制御の関係を調べた。その結果、ade6-M26点突然変異によってもたらされるCRE様転写制御配列に特異的に結合する転写因子Atf1/Gad7-Pcr1が、その周辺にクロマチン再編成をもたらし、ひいては組換えの活性化を誘導することを明らかにしてきた。
また、このクロマチン再編成が、ストレス応答MAPキナーゼやcAMP情報伝達経路、および接合型フェロモン情報伝達系や減数分裂誘起因子などによって重層的に制御されていることを示した。さらには、クロマチン再編成と組換えを開始するDNA二本鎖切断反応が、ホットスポット周辺のヒストンのアセチル化レベルによって制御されていることをはじめて示した。このヒストンのアセチル化には、出芽酵母からヒトまで保存されているGcn5ヒストンアセチル化酵素がきわめて重要な役割を果たすことを示した。
以上に加え、fbp1、cgs1、ctt1、gpd1、pyp2、rst2、ptc1などの遺伝子座の転写制御領域に存在する天然のCRE様配列における減数分裂期のクロマチン構造変化を調べたところ、cgs1とptc1を除くほぼすべての遺伝子座で何らかのクロマチン再編成が起きていることを明らかにした。以上の結果は、クロマチン再編成を通じた普遍的な組換え制御機構の存在を示唆している。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】2,700千円 (直接経費: 2,700千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09780669 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

出芽酵母 / 複製開始点 / Mrell / 染色体ドメイン / 組換えホットスポット / クロマチン / 組換え / ホットスポット / 酵母第三染色体 / クロマチン構造 / 転写因子

【研究成果の概要】

本年度はまず、第三染色体上でほとんどDNA二本鎖切断の起こらないコールド領域のクロマチン構造を解析した。コールド領域に存在するPOL4遺伝子座では、二本鎖切断は見られないものの、減数分裂期への移行にともない顕著な転写量の増大が見られる。解析の結果、減数分裂期にこの遺伝子のプロモーター領域で顕著な球菌ヌクレアーゼに対する感受性の増大が観察された。しかし、POL4領域では他の二本鎖切断が生じる活性型ホットスポットと異なり、mre11遺伝子破壊株でも全く同じ様な変化が認められた。これに対して、コールド領域で例外的に二本鎖切断が見られるARS310域周辺のホットスポットに対応する箇所では、Mre11に依存した球菌ヌクレアーゼに対する感受性の増大が認められた。以上の結果は、コールド領域でMre11を初めとした組換え開始複合体のアクセスが制限されている可能性と、ARS310がその制限を解除している可能性を示唆する。そこで次に、ARS310を染色体から欠失させた株を入手し、そのクロマチン構造への影響を調べた。その結果、ARS310を欠失させた場合、その周辺全体のDNA受容度の低下と、隣接する遺伝子座でのヌクレオソーム配置の不規則化が観察された。以上の結果は、ARS310がその周辺の染色体領域のクロマチン構造を開いた状態に規定し、組換え因子の接近を容易にしている可能性が初めて示唆するものである。また、これ以外の領域(ARS領域などの領域含む)についても順次解析を進めており、結果を蓄積している。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】08780688 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

減数分裂 / クロマチン / 染色体 / 組換え / クローニング

【研究成果の概要】

本年度は、以下の2点について成果を得た。
1.分裂酵母のade6M26は、ade6ORFに生じた点突然変異に起因する減数分裂期特異的なホットスポットで、変異箇所を含む7塩基配列がホットスポット活性に必須である。ホットスポットにおけるクロマチン構造の役割について一般性を検討するため、ade6M26のクロマチン構造を解析した。その結果、M26に依存して変異箇所周辺で顕著なクロマチン構造の再編成が起きていることを見出した。また、出芽酵母と同様のDNAの受容性の増大が認められた。さらに、7塩基配列に点突然変異を導入すると、ホットスポットのクロマチンはもともとのade6遺伝子座の状態に戻った。以上の結果は、減数分裂期組換えの開始に関するクロマチンレベルの制御が、種を越えて保存されている可能性を示唆する(水野ら、Genes & Development,印刷中)。
2.分裂酵母の組換えに関する遺伝子のクローニングを進め、出芽酵母のMRE11、SPO11遺伝子に相同なrad32^+およびrecl2^+遺伝子のゲノミック・クローンを単離した。これらの遺伝子の欠損により、減数分裂時の組換えが低下することが知られている。また、スイスのグループと共同で、RAD50遺伝子の分裂酵母ホモログsprad50^+を単離し、現在遺伝子破壊を行って、減数分裂組換えに及ぼす影響などを調べている。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1996

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】07780639 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

出芽酵母 / 組換え / ホットスポット / クロマチン / MRE11 / RAD50

【研究成果の概要】

遺伝的組換えは、減数分裂において著しい活性化を受けるが、その仕組みについては不明な点が多い。出芽酵母減数分裂期組換えの大半は、ホットスポットと呼ばれる特定の染色体領域に生じるDNAの二重鎖切断によって開始される。これまでに、このホットスポット領域のクロマチンが、ヌクレアーゼの攻撃を受けやすいオープンな状態になっていること、またクロマチン構造が減数分裂期に変化し、さらにヌクレアーゼの攻撃を受けやすい状態になることを示した(Ohta et al.,EMBOL J. 13,p5754,1994)。本年度は、クロマチン構造変化に関わる遺伝的要因を調べた。その結果、二重鎖切断に必須な遺伝子であるMRE2とMRE11がクロマチン構造変化に関与していることを明らかにした。一方、二重鎖切断に必須なRAD50遺伝子を破壊した株では、有為なクロマチン構造変化が認められた。RAD50とMRE11の二重変異株について調べると、クロマチン構造変化はMRE11欠損株と同程度にまで抑制されていた。以上の結果から、1)クロマチン構造変化が組換え開始に必要な因子に依存していること、2)クロマチン構造変化は二重鎖切断より前に起こる反応であることが示された。また、RAD50とMRE11の遺伝子産物同士が複合体を形成している可能性が示唆されていることを考えあわせると、クロマチン構造変化はMRE11遺伝子産物を含む組換え開始複合体がホットスポット上に相互作用する状態の反映と考えられる(投稿準備中)。MRE11及びRAD50を大腸菌及び酵母における大量発現ベクターに導入し、大量発現を行った。大腸菌で発現した蛋白質を精製し、抗体を作製した。抗Mre11p抗体及び抗Rad50p抗体と酵母抽出液を用いて免疫沈降法などを行い、組換え開始複合体の単離を進めている。MRE11遺伝子の過剰発現が減数分裂期組換えにどのような影響を与えるかを調べたが、現在までに有意な変化は認められていない。また上記研究過程で、減数分裂期に活性化されるミトコンドリア由来の新規のエンドヌクレアーゼを見出し、その性質を明らかにした(Mol. Gen. Genet. 印刷中)。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1995

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)