Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

リプログラミング / 創傷治癒 / 遺伝子導入 / アデノ随伴ウイルスベクター / 再プログラム化 / 遺伝子治療 / 皮膚潰瘍 / 直接転換 / 上皮化 / 組織胎児化 / 難治性潰瘍

本研究では申請者が開発を進めてきた「皮膚潰瘍に存在する間葉系細胞から上皮細胞への細胞系譜の転換を介して、潰瘍面から直接的に上皮化、創傷の閉鎖をはかる皮膚潰瘍治療法」の臨床応用へ向けた研究開発を進めている。
特に皮膚皮下組織の間葉系細胞に特化した指向性を有するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を開発する目的で、AAVの一部をランダム化したペプチドディスプレイウイルスライブラリを作成し、マウス皮膚潰瘍面を用いた定方向進化法をかけることによって新しいカプシドを開発した。Deep learningによる病理組織解析手法を導入することによって動物間のばらつき、実験手技によるばらつきの影響を最低限に抑えながら、定量的に比較検討を行う方法について最適化を進め、新規開発したAAVカプシドの既存カプシドに対する優位性を確認した。また、類似の原理に基づいて、誘導された上皮に対して遺伝子導入を行うための新規AAVカプシド候補セットを開発した。
一方、複数の転写因子を単一の細胞に対して同時に遺伝子導入するためのポリシストロニックベクターの開発を目的として、転写因子セットの全配列順に連結したウイルスベクターコンストラクトを作成し、ヒト・マウス細胞を用いてin vitro細胞系譜転換実験を行い、転換効率の観点から細胞系譜転換に最適な配列順が明らかとなった。当該ポリシストロニック配列を搭載することが可能な大容量ウイルスベクター作成を目的としたバックボーンプラスミドコンストラクト作成を進めた。
そのほか、皮膚潰瘍面への遺伝子治療臨床応用に際しての障壁として危惧されるOff target効果を最低限とするための新しい化学物質を用いたコントロールリリース法、長期的に実験・観察が可能な新規皮膚潰瘍動物モデルの開発と解析を進めた。

遺伝子導入 / アデノ随伴ウイルスベクター / 毛髪再生 / hair / 直接転換 / 形成外科

強い皮膚へのダメージによって毛髪の失われた皮膚において、新たに毛髪を再生させる方法を開発するために、培養細胞に対して遺伝子導入を行うことによって、本来毛髪にならない細胞に毛髪をつくる能力を与える方法を開発した。さらに生きた動物の皮膚に対して、臨床的に実用可能な方法でこの技術を応用することを目的としてアデノ随伴ウイルスベクターという新しい遺伝子導入方法の開発を進めた。

現時点では、一度失われた毛髪を取り戻す良い方法は存在しない。本研究によって、毛髪のもとである毛包を構成する細胞の性質を決定づけている因子が明らかとなった。生体を構成する細胞の基本的な機能の理解、新しい治療方法開発の基礎となるに重要な知見であると考えられる。また皮膚を構成する複数種類の細胞に対して高い遺伝子導入効率を有するアデノ随伴ウイルスベクターの開発が進んだことは、皮膚の関連する疾患全般に対する新しい治療方法開発の重要な技術的進歩である。

ケラチノサイト / 重層扁平上皮 / 遺伝子導入 / 直接転換 / リプログラミング / 線維芽細胞 / 創傷治癒 / 皮膚潰瘍

皮膚潰瘍に存在する間葉系細胞から表皮ケラチノサイトへの直接転換による皮膚潰瘍治療方法の開発を目的として、真皮線維芽細胞に遺伝子導入することによって、ケラチノサイト同様の重層扁平上皮を形成する能力をもつ細胞への作製を試みた。
初代培養真皮線維芽細胞、表皮ケラチノサイトのmicro RNA array, micro array, いくつかのbioinformatic analysisの結果より、80余因子を選択し、レンチウイルスベクターを用いて皮膚線維芽細胞への遺伝子導入を行った。様々な組み合わせを検討した結果、29因子の導入により、表皮ケラチノサイト類似の形態、増殖動態を呈する細胞を誘導することができた。コラーゲンゲルを担体として用いた皮膚3次元培養において、誘導された細胞が重層扁平上皮形成能を有することを確認した。
誘導細胞の導入遺伝子特異的PCRの結果より、9因子がゲノム遺伝子に組み込まれていることが示唆されたため、同9因子を真皮線維芽細胞に遺伝子導入したところ、表皮ケラチノサイト類似の形態、増殖動態を呈し、3次元培養において、重層扁平上皮形成能を有する細胞を得ることができたため、今後は更なる因子の減少、最適化を進めていく。
本研究の結果より、外来性の遺伝子導入により、皮膚間葉系細胞から、重層扁平上皮形成能を有する細胞へ直接的な細胞系譜の転換を起こすことができることが明らかとなった。更なる最適化によりin vivo、潰瘍局所での転換を惹起することができれば、あらゆる原因からなる皮膚潰瘍病変を短期間で上皮化させる新しい治療として応用することが可能である。

直接転換 / ケラチノサイト / 線維芽細胞 / 創傷治癒 / リプログラミング / 遺伝子導入 / 間葉上皮移行 / 上皮化 / 間葉上皮転換 / マイクロRNA / 皮膚潰瘍 / 皮膚線維芽細胞 / 脂肪幹細胞

皮膚潰瘍局所に存在する間葉系細胞から上皮細胞への直接的な転換を惹起することにより、周辺上皮細胞の遊走によらない潰瘍面からの直接的な上皮化をきたす新しい治療方法開発を目的として、直接転換候補因子の検索、候補因子の遺伝子導入によって線維芽細胞におきる変化を調べた。マイクロアレイデータ、文献検索、バイオインフォマティクス解析によって55転写因子、30マイクロRNAを選択し、これらをヒト線維芽培養に導入し、ケラチノサイト培養条件に継代したところ、遺伝子導入後1-2週程度で、ケラチノサイトに類似の形態、増殖動態を呈する細胞群を得るにいたった。

【研究分担者】
金山幸司	東京大学	医学部附属病院	助教	(Kakenデータベース)
岡崎睦	東京大学	医学部附属病院	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
栗田昌和	東京大学	医学部附属病院	助教	(Kakenデータベース)
金山幸司	東京大学	医学部附属病院	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
江藤ひとみ	杏林大学	医学部	助教	(Kakenデータベース)
菅浩隆	杏林大学	医学部	助教	(Kakenデータベース)