Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

行動 / タンパク質 / ELISA / チオNADサイクリング法 / CREB / モノアラガイ / 行動学 / 神経化学 / 生物物理学 / 脳・神経 / 蛋白質

モノアラガイでの味覚嫌悪学習のキー・ニューロン内でのCREB1タンパク質の定量を試みるのが本研究の目的である。まずはその検出方法であるが、当該のタンパク質の抗体を用いたELISA法に、チオNAD酵素サイクリング法を組み合わせたものを適用し、極微量のタンパク質でも定量できるようにその測定方法の開発に努めた。サイクリング法での脱水素酵素として3α-hydroxysteroid dehydrogenaseを用い、かつ基質としては改変したandrosteroneを用いて、300回転/分以上のサイクリングを実現した。これは、androsteroneの17位を修飾することによって成功した。また酵素反応の至適条件も見直し、バッファー組成のリン酸基濃度を増やした。さらには、標識酵素としてアルカリホスファターゼまたはβガラクシダーゼのどちらを適用し、市販のプレートリーダーを用いた測定系で、10^<-20>moles/well以上の検出限界を達成できた。さて次に、CREB1タンパク質を、上述のアルカリホスファターゼを標識酵素として用いて定量してみた。しかしながら、現時点では高感度は得られておらず、行動変容に特に関与するニューロン1個内のCREB1タンパク質を定量できるまでには至っていない。問題点は、抗体の精度にあることは明らかとなったので、現在は、その抗体の精度を上げるように努めている。

CREB / C / EBP / モノアラガオ / mRNA / タンパク室定量 / 行動変容 / ELISA法 / 酵素サイクリング法 / 抗体カラム / 抗体 / real-time PCR / 学習記憶 / 分子動力学 / モノアラガイ

本研究の最終目的は,一つの神経細胞の中の特定の遺伝子発現が,どのように動物個体の行動変容を引き起こすのか,その機構を解明する手法を開拓し,そして実際に,遺伝子発現機構から生物の階層性に沿った形で行動変容機構を詳細に解明するところにあった.そこで行動変容の根元である学習・記憶のメカニズムに的を絞った.まずは,学習・記憶に関与している神経細胞一個の中の転写因子cAMP Responsive Element Binding Protein(CREB)ならびにCCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)のmRNAおよびタンパク質を定量する方法を開発することを目指した.ここで言う定量とは,mRNAならコピー数,タンパク質なら個数を正確に計測することを意味する.単一神経細胞内のmRNAならびにタンパク質の定量について考えてみた.例えばCREBファミリーには,転写促進型のCREB1と抑制型のCREB2の両者が存在するという事実もあり,CREBの量的なダイナミクスを明らかにしなければ,ただ単にCREBが長期記憶形成に大事だという主張をいくら繰り返えしても意味がない.そこでその現状を打破するためにmRNAやタンパク質の定量方法の開発に挑んだ.しかもその定量では,脳組織という複数の神経細胞を扱うわけではなく,たった一つの神経細胞中のmRNA・タンパク質の量を測ることにした.たった一つの神経細胞内の変化を正確に測定する方法の開発が切に望まれている.次に,この計測方法を用いて,学習個体から単離してきた学習・記憶に関わる特定の単一神経細胞内でのCREBまたはC/EBPのmRNAならびにタンパク質の量的変化を確認した.その後,今度は逆に,その神経細胞中のCREBの量を人為的に変化させることによって,行動変容に至るどの階層性でどのような影響を与え得るのかを,階層性をボトムアップで昇って調べて行った.

学習 / 記憶 / CREB / 単一細胞解析 / in situハイブリダイゼーション / 免疫組織化学 / qRT-PCR / モノアラガイ / C / EBP / mRNA / 味覚嫌悪学習 / スプライシング / NO合成酵素 / 長期促通 / アンチセンス・オリゴヌクレオチド

本研究では,脳の構造は簡単ではあるが複雑な学習を修得できる軟体動物腹足類のヨーロッパモノアラガイ(Lymnaea stagnalis)を用い,その味覚嫌悪学習の機構を例にとって,脳の階層性を確実に反映した学習・記憶機構の理解に努めることを目的とした.研究代表者らは,ヨーロッパモノアラガイの味覚嫌悪学習の鍵を握るキー・ニューロン(Cerebral Giant Cell)を同定することができた.そして,脳の階層性をトップダウンで降りてくることによって,長期記憶形成時にこのキー・ニューロン内では,cyclic AMP respohsive element binding protein 1(CREB1)の活性化が起こっていることもわかった.そこで,モノアラガイのCREBをクローニングし,in situハイブリダイゼーション法ならびに免疫組織化学法によって,それらが局在するニューロンを同定した.上述のキー・ニューロンにおいてもCREB1およびCREB2のmRNAの存在が確認された.以上の結果から,モノアラガイを用いることによって,一連の階層性に正確に沿ったボトムアップ法での解析が可能となることも示すことができた.代表研究者の講座において,定量real-time RT-PCR装置が導入され,この装置のお陰で,単一神経細胞内のCREB mRNAが定量解析できるようになった.そこでキー・ニューロン一つを単離して,CREBのmRNAコピー数を測ったところ,CREB2のmRNAが数百コピー存在することを示すことができた.この結果は,学習・記憶に伴う遺伝子発現量変化を,たった一つのニューロン内で定量測定する道を拓いたものと言える.

【研究分担者】
松尾亮太	徳島文理大学	香川薬学部	講師	(Kakenデータベース)
小林卓	徳島文理大学	香川薬学部	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
松尾亮太	徳島文理大学	香川薬学部	講師	(Kakenデータベース)
小林卓	徳島文理大学	香川薬学部	助手	(Kakenデータベース)
定本久世	徳島文理大学	香川薬学部	助手	(Kakenデータベース)
箕田康一	徳島文理大学	香川薬学部	助教授	(Kakenデータベース)
齊藤玉緒	北海道大学	大学院理学研究院	助手	(Kakenデータベース)