【研究領域課題番号】20K20376 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質二重膜 / X線結晶解析 / 膜蛋白質 / 結晶 / 結晶解析 / 結晶大型化 / 構造生物学

【研究成果の概要】

膜蛋白質の真の構造生物学を目指し、「脂質二重膜からプロトンまで」の全てを可視化する技術の開発に取り組んでいる。第一の目標は膜蛋白質結晶中の脂質二重膜の可視化であり、具体的課題は分解能10Åよりも低角の反射点の位相決定である。溶媒コントラスト変調法の拡張と多重同型置換法、その両者の組み合わせの適用を考え、技術開発とデータ収集を行った。さらに、中性子回折への発展を考え、膜蛋白質の大型結晶の作製技術の開発を試みた。

【研究の社会的意義】

本研究の結果、低角反射に対する位相決定技術が拡充され、既に実績のある溶媒コントラスト変調法に関しても適用できる結晶が大幅に拡大した。その結果、これまでX線結晶解析が機能しないためにごく限られた知見しかない、燐脂質と膜蛋白質との相互作用の詳細を明らかにすることが可能になった他、蛋白質結晶中で熱運動が大きくて解像できなかった糖鎖等も解像できるようになった。クライオ電子顕微鏡法では燐脂質頭部が解像されないことが多いため、本研究で開発した技術との組み合わせも追及されるべきであろう

【研究種目】挑戦的研究(開拓)

【研究期間】2020-04-01 - 2022-03-31

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究領域課題番号】18H03512 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経インタフェース / 脂質二重膜 / カーボンナノチューブ / ジャイアントリポソーム / ゲルボール / 管状ナノ構造物 / ギャップジャンクション / 膜タンパク質 / MEMS / ＭＥＭＳ / 黒膜形成 / ナノポア支持型脂質二重膜 / PDMS

【研究成果の概要】

電気シナプス（ギャップジャンクション）を人工的に実現する本神経インタフェースデバイスは，従来デバイスで問題となっている生体適合性と電気化学的な諸問題を解決できるデバイスである．提案デバイスの特徴は，膜の安定化の目的でボール形状のゲル物質周りに脂質二重膜を構成し、ギャップ結合を実現するために膜タンパク質など膜を貫通するカーボンナノチューブ（CNT）を介して物質輸送を行う点である．
本年度は，昨年度に立ち上げた電気特性の評価実験系を使って，膜タンパク質（αヘモリシン）を導入したゲル内包ジャイアントリポソーム（GUV）に対し，パッチクランプ法を用いた電気特性評価を実施した．その結果，膜の容量の変化，ボルテージクランプによる膜電位のステップ状の変化を見ることができ，膜タンパク質が膜内に挿入されて物質輸送の機能を果たしていることを電気的に確認した．
また，GUVにCNTを組み込み，蛍光顕微鏡下でCNTを介した膜内外の物質輸送の様子を顕微鏡下で観察したところ，リポソーム膜に大きな破壊が見られないこと，蛍光の変化からリポソーム外部から内部へCa2+ が輸送されることを確認した．しかし必ずしも蛍光の変化は期待したほどではなかったため実験を繰り返したところ， CNTと脂質二重膜の間に隙間ができており，その隙間からCa2+が漏れ出ている可能性が見えてきた．以上の実験から，CNTと脂質二重膜との親和性についてより深く検討する必要があることが判明した．なおパッチクランプ法を用いて，Ca2+の透過率を評価する電気特性実験を行ったが，安定した結果が今のところ得られていないため，その原因について現在追及している段階である．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究領域課題番号】18K06148 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Na+,K+-ATPase / イオン能動輸送 / 膜蛋白質 / X線結晶構造解析 / 能動輸送 / イオン選択性 / 電子顕微鏡単粒子解析 / 脂質二重膜 / Na+ポンプ / イオン選択機構 / 量子化学計算

【研究成果の概要】

Na+,K+-ATPaseは全ての動物細胞の細胞膜に局在し、ATP 1分子の加水分解エネルギーを利用して3個のNa+を細胞外へ、2個のK+を細胞内へ濃度勾配に逆らって輸送する膜蛋白質である。Na+の選択的輸送の理解に向けてNa+を結合した直後の状態、すなわちE1・3Na+状態の構造解析を行った。また、E1・3Na+状態の結晶を用いて、E1・Mn2+状態の構造、ATPアナログと結合したE1・3Na+状態およびE1.Mn2+状態の構造も明らかにした。これらの構造解析から、Na+ポンプはNa+を結合した時のみ燐酸化状態に進める、言わば安全装置のような仕掛けがあることが明らかになった。

【研究の社会的意義】

Na+,K+-ATPaseは生体内ATPの60%以上を消費するとも言われ、それによって形成されるイオン濃度勾配は様々な生命活動の基盤を成している。Na+,K+-ATPaseの異常は神経変性など多くの疾患の原因となるだけでなく、癌などに対する薬剤標的としてもNa+,K+-ATPaseは有用であることが多く示されている。したがって、その能動輸送の詳細な理解は学術的にも産業的にも重要である。本研究はなぜ、Na+だけを選択的に輸送できるのか、その仕組みを原子レベルで明らかにした。その巧妙な仕組みは学術的に興味深いだけでなく、遺伝性疾患におけるNa+,K+-ATPaseの異常の理解にも役立つものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】17H04999 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核磁気共鳴法 / シグナル伝達 / 膜タンパク質 / Gタンパク質共役型受容体 / 脂質二重膜 / 薬学 / 生物物理 / 蛋白質 / 免疫学 / 構造生物学

【研究成果の概要】

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は、様々な細胞外からの刺激に応答する膜タンパク質であり、感覚受容・神経伝達など、様々な生理機能に関与している。本研究では、タンパク質の動的な性質を原子レベルで観測可能な核磁気共鳴（NMR）法を用いて、GPCRの一種であるβ2アドレナリン受容体およびアデノシンA2A受容体の解析をおこなった。これにより、β2アドレナリン受容体が化合物依存的に、多様なシグナルを細胞内に伝える機構、および脂質二重膜の組成依存的にアデノシンA2A受容体の活性が変化する機構を解明した。

【研究の社会的意義】

医薬品の30%以上は、G蛋白質共役型受容体（GPCR）に作用して、シグナル伝達活性を変化させることで、治療効果を発揮する。本研究で得られたGPCRの構造を参考にして、下流のシグナルを伝達する分子との相互作用に、選択的に作用する化合物を作ることができれば、副作用を抑制する薬剤を、合理的に設計できる可能性が示された。また、脂質の作用を模倣することで、生体内に存在する化合物や他の薬剤がすでに結合したGPCRに対しても作用する薬剤設計の道が開け、新たな作用点および薬理作用を持つ医薬品の開発が加速することが期待される。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】26,130千円 (直接経費: 20,100千円、間接経費: 6,030千円)

【研究分野】マイクロ・ナノデバイス

【研究領域課題番号】19310087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜蛋白質 / マイクロチャンバー / 脂質二重膜 / アレイ技術 / 膜輸送 / 膜タンパク質

【研究成果の概要】

マイクロチャンバーアレイを利用して,生体の膜輸送タンパク質の輸送効率を評価する実験系の構築を行った.膜タンパク質を再構成するためには、人工脂質二重膜を高効率で形成する必要があり、その基盤技術を確立した。最終的に、人工脂質二重膜にABC輸送膜タンパク質を再構成し,それらにより輸送基質分子を微小空間(マイクロチャンバー)中に蓄積させ,蛍光顕微鏡による検出を試みた.本課題では、解決すべき課題が残るものの、膜輸送タンパク質の輸送を定量評価するための有力な技術基盤を確立した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】20,150千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 4,650千円)

【研究分野】マイクロ・ナノデバイス

【研究領域課題番号】18310092 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マイクロ流体デバイス / 膜タンパク質 / 網羅的解析 / MEMS / Lab on a Chip / 脂質二重膜 / 膜タンパク質チップ / 脂質2重膜 / リポソーム

【研究成果の概要】

18年度はまず、我々が考案した接触法を利用して、様々直径めリポソームが形成できることをした。まず、膜タンパク質の導入された脂質2重膜にガラス管などのマイクロノズルを近づけ、ジェット流をパルス的に発射する。このジェット流のパルス幅(時間)および、膜とノズルの距離、ノズル直径など、さまざまなパラメータを調整し、直径をある程度制御可能な条件を明らかにすることができた。ジェット流の発射の際に、主要なべシクルのほか、小さいベシクルもできるサテライト現象が起きることも分かった。これらを積極的に利用することによって、より小さいベシクルを作成できることもわかってきた。
また、膜作成において、平面膜の作成法に関しても研究した。微細加工を利用して、マイクロサイズの微小孔を作成し、内部に脂質2重膜を作成する。孔の形成には、高分子フィルムであるパリレン樹脂を利用した。その結果、複数の孔に安定して2重膜が再構成できることが分かった。これらの結果の一部は18年度の化学とマイクロシステム国際会議(microTAS2006)にて発表し、好評を得た。
続いて19年度は、、実用化に向けて大量にベシクルを作製するために、安定した平面膜アレイの構築を目指した。接触法を応用し、3x3の平面膜を電気的に絶縁した状態で形成することに成功した。さらにそこヘチャンネル電流を発生するペプチドや膜タンパク質を導入し、活性が維持されることを電気的に計測した。また、多チャンネルでの同時計測にも成功した。
これらの研究成果によって、多チャンネル同時計測が可能な膜タンパク質チップの創製へ大きく近づいたと考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,290千円 (直接経費: 15,700千円、間接経費: 1,590千円)