【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】20790744 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小児神経学 / 神経前駆細胞 / 大脳皮質発生 / 分化誘導 / 細胞周期 / p27Kip1 / マウス

【研究成果の概要】

細胞周期調節遺伝子p27^<Kip1>は神経前駆細胞が神経細胞に分化する際重要な役割を果たす。本研究はp27^<Kip1>の発現を調節する転写因子を特定することを目的に実施した。マウス胎仔神経前駆細胞から細胞核成分を調整し、p27^<Kip1>5'非翻訳領域プロモーター配列のDNA断片ビオチン化プローブを反応させたところ、未同定のタンパク質と結合したプローブ由来シグナルを検出した。しかし抗体添加によるシグナルのシフトを認めず、未同定の結合タンパクは初期に想定していたFOXO1a、FOXO3aではないことが判明した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】20390299 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エピジェネティクス / 大脳皮質発生 / 神経前駆細胞 / マウス / 細胞周期 / ヒストン脱アセチル化 / 神経発生 / 大脳皮質

【研究成果の概要】

近年、遺伝子の塩基配列に依らない遺伝子発現機構(エピジェネティクス機構)が神経発生に重要な働きを持つのではないかと考えられている。本研究ではエピジェネティクス機構を担うヒストン脱アセチル化酵素を神経幹細胞にのみ時期を限定して発現可能なマウスを作成した。ヒストン脱アセチル化酵素を神経幹細胞に強制的に発現させると、細胞分裂動態に変動を認めたことから、大脳皮質の組織に異常を生じる可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】18390302 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エピジェネティクス / 大脳皮質発生 / 神経前駆細胞 / マウス / 細胞周期 / アセチル化

【研究成果の概要】

本研究では、大脳皮質を形成する神経前駆細胞の細胞周期調節機構に、エピジェネティクス機構、特にクロマチン構造を制御するヒストン脱アセチル化酵素が果たす役割を解明する目的で以下の実験行った。
方法1.妊娠10-16日目のマウス神経前駆細胞の核抽出液を調整した。抗アセチル化ヒストン抗体でウエスタンブロットを行ないヒストンのアセチル化状態を確認した。2.上記調整サンプルと種々の抗アセチル化ヒストン抗体でクロマチン免疫沈降を行い、細胞周期調節遺伝子のプロモーター領域に対するプライマーを用いてPCRを行った。3.ヒストンのアセチル化を修飾するhistone deacetylases、Sir2に対するウエスタンブロット解析を行った。4.Tet-systemと神経幹細胞特異的プロモーターであるnestin遺伝子のintron II promoterとを組み合わせ、ドキシササクリン(DOX)投与によりSir2を神経幹細胞で時期特異的に発現可能なマウスの作成を試みた。
結果1.発生が進むに従いアセチル化ヒストンH3lys9が増加した。その他既知のH3、H4アセチル化部位は不変であった。2.神経前駆細胞の分裂が進むに従いp27Kip1,p57Kip2等のプロモーター領域が抗アセチル化ヒストンH3lys9抗体により免疫沈降した。3.神経前駆細胞の分裂が進むに従い核内脱アセチル化酵素Sir2のみ減少した。4.TRE配列の下流にSir2遺伝子を挿入した遺伝子断片を持つトランスジェニックマウス(TRE-Sir2)を5ライン作成したが、Sir2を強制発現可能なラインを見つけることができなかった。
考察Sirt1はNAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素Sir2のマウスホモログ蛋白質であり、酵母のカロリー制限下での寿命延長に重要な役割を果たしていることが知られ、またSirt1欠損マウスでは大脳発生に異常をきたす。以上から神経前駆細胞の細胞周期が進むにつれてSirt1の発現量が減少し、その結果アセチル化ヒストンH3 lys9が減少、CDKIのプロモーターが解放されている可能性がある。
強制発現可能なトランスジェニックマウス作成を試みたが、DOX投与量の増量、投与時期・期間の調整にも関わらず、導入遺伝子由来の蛋白質・mRNAを検出可能なラインを見つけることができなかった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,000千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 2,100千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】17790723 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経前駆細胞 / 大脳皮質発生 / 分化誘導 / 細胞周期 / p27Kip1 / マウス

【研究成果の概要】

CDK抑制遺伝子p27Kip1は増殖抑制・分化誘導に重要な細胞周期調節蛋白である。神経前駆細胞では大脳皮質発生が進むに従い核内p27Kip1蛋白が増加、分化後の神経細胞で発現が高値となる。
また、P27Kip1欠損マウス(P27KO)では、大脳皮質が約10%肥厚することが報告されている(Goto et al.,2004)。本年度は、p27KO大脳皮質の肥厚化は、神経前駆細胞の細胞分裂動態が変化した結果である、という作業仮説のもと、以下の実験を行った。
方法1.妊娠16日(E16)のp27KOおよび野生型胎児にS期特異的トレーサーであるBrdUを継続的に曝露し、細胞周期各相の長さを計測した。2.E16のp27KOおよび野生型胎児にS期特異的トレーサーlrdUとBrdUを2時間の時間差をもって曝露し、細胞周期を離脱した細胞数を計測した。2.E16胎児に一回lrdUを曝露し、出生後21日目(P21)大脳皮質内のlrdU陽性GABA陰性ニューロンの位置と数を計測した。
結果 1.E16の神経前駆細胞のG1期がp27KOにおいて約2時間減少した。2.神経前駆細胞のうち細胞周期を離脱した細胞数が約50%増加した。3.E16で産生されたlrdU陽性GABA陰性投射ニューロンは大脳皮質表層のII-IV層に分布した。p27KOでは野生型と比較し上記細胞が14%増加した。
考察 p27KOでは大脳皮質発生初期に分化誘導の確率(Q値)が減少することが判明している(Goto et al.,2004)。今年度の研究結果より、初期のQ値が減少することにより神経前駆細胞プールが増加、発生後期にQ値が増加することで最終的に大脳皮質表層の投射ニューロンが増加する可能性を明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】15390327 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大脳皮質発生 / 胎内曝露 / 神経前駆細胞 / マウス / 分化誘導 / 細胞周期 / p27Kipl / TCDD / p27Kip1 / ダイオキシン

【研究成果の概要】

近年、環境汚染物質が生体に与える影響が懸念されており、特に胎児発生への影響については社会的関心が高い。環境汚染物質であるダイオキシン(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)は、培養細胞において細胞分裂動態に影響を与えることが知られている。さらに、胎内曝露したラットで出生後の空間記憶能力が障害されるなど、高次脳機能発達障害の原因となる可能性が報告されている。そこで、TCDD胎内曝露が大脳皮質発生に与える影響を解明することを目的として、TCDD胎内曝露脳の大脳皮質発生過程を、大脳皮質発生の数学モデルを応用し定量解析した。
【方法】妊娠7日のマウスにTCDD(20μg/kg体重)を1回経口投与、胎生12日目のマウス胎児前脳を用いて、神経前駆細(NPC)の(1)細胞周期調節遺伝子発現・局在の変化、(2)細胞周期長、(3)分化誘導の確率(Q値)、について解析した。さらに生後21日のマウス終脳を用いて、(1)終脳の全長・全幅、(2)大脳皮質の厚さ、(3)抗GABA免疫組織化学染色切片を用いた皮質各層のGABA陽性・陰性細胞、グリア細胞数・密度について解析した。
【成績】平成15年度〜平成16年度の研究期間に、TCDD胎内曝露は(1)神経前駆細胞(NPC)内のp27Kiplの核内存在量を増加、(2)大脳皮質発生早期にNPCのG1期を延長、(3)大脳皮質発生早期にNPCの化誘導の確率(Q値)を増加、(4)最終的に形成される大脳皮質深層の投射ニューロン数を減少させ非薄化させること、を明らかにした。
【考察】TCDD胎内曝露が大脳皮質発生異常(薄い大脳皮質)の原因となること示した。TCDD胎内曝露により、胎生12日目でのp27Kipl核内局在量が増加、NPCの早期の異常な分化誘導亢進が、最終的に大脳皮質の菲薄化につながることを示した。皮質深層のGABA陰性細胞のみがTCDD曝露群で減少していた理由として、TCDD曝露が皮質発生早期にNPCの分化誘導を異常に亢進させた結果、皮質浅層のGABA陰性細胞に異常に分化した可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】14,500千円 (直接経費: 14,500千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】13670837 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大脳皮質発生 / 細胞周期 / 分化誘導 / マウス / 神経前駆細胞 / CDK / 神経系前駆細胞

【研究成果の概要】

<背景>
CDK抑制遺伝子p27Kip1は、増殖抑制・分化誘導に重要な細胞周期調節蛋白であることが、培養細胞の研究で明らかとなっている。p27Kip1ノックアウトマウス(p27KO)では各臓器が約30%増大し、大脳のサイズも増大する。以上より、p27Kip1は大脳皮質を構成する神経細胞数を調節する役割を担っている可能性がある。本研究では、p27KOにおける神経前駆細胞(neural progenitor cell, NPC)の分裂増殖・分化誘導パターンを定量解析し、大脳皮質形成におけるp27Kip1の役割を検討した。
<結果>
まず平成13年度において、妊娠14日における胎仔大脳壁の皮質板と中間帯の厚さがp27KOで有意に増加していること、細胞周期を終え分化を開始したQ細胞のうち脳表に近いピークが、p27KOでは構成細胞数が野生型に比して少なく大脳表層に向かってシフトしていることを明らかにした。
また平成14年度において、妊娠14日におけるNPCの細胞周期長を測定し、野生型とp27KOで差異を認めず、との結果を得た。
<考察>
妊娠14日以降にNPCより産生されるニューロン数の増加は、1.NPC分裂回数の増加(細胞周期の短縮)、2.Q値の変動(少なくとも妊娠14日までは低値、その後急速に増加)のいずれか、または両者で説明可能である。今年度の研究結果より、妊娠14日においてp27KOのNPC細胞周期長に変化を認めなかったことより、p27KOの大脳皮質発生異常は、Q値の異常に基づく可能性が強く示唆された。これらの知見に基づき、今後さらに詳しい解析を行う予定である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】11670784 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マウス / 細胞周期 / 成長因子 / Gap Junction / 大脳皮質発生 / 神経幹細胞 / 分化誘導 / Mitogen / Antimitogen / GAP Junction / FGF2 / 細胞分裂 / Q Fraction / 組織培養

【研究成果の概要】

平成11年度
塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)が神経幹細胞の増殖動態にどのような影響を及ぼすかをマウス大脳皮質組織培養系を用いて検討し、FGFが細胞周期のG1期において娘細胞の分化を阻害すること、すなわちQ fraction(Q)を減少させることを示した。これはFGFが広義のmitogenであることを大脳皮質の発生において立証したものである。
平成12年度
gap junction阻害剤、1-octanol(OCT)が神経幹細胞の増殖・分化に及ぼす影響について検討した。gap junction(GJ)は脳室層神経幹細胞を連結することで情報伝達に重要な役割を果たしており、大脳皮質発生後期には減少する。その機能を阻害すればanti-mitogen様の効果、すなわち増殖抑制、分化誘導がおこると予想される。
胎生13日胎仔の大脳皮質組織片を組織培養、培養液にOCTを添加した群と添加しない群(対照)について、ブロモデオキシウリジン(BUdR)持続曝露(cumulative labeling法)により細胞周期長を、トリチウム標識チミジン・BUdR時間差投与(double labeling法)によりQを測定した。
OCT投与により、細胞周期の長さは不変、Qは著しく増大した。Qの変化は皮質発生が先行している大脳皮質外側部で認められ、遅れている内側部では認められなかった。以上、OCTは細胞周期長には影響を与えずに、Qを増大、すなわち神経幹細胞を分化誘導することが示された。また、その効果は発生がより進行している部位においてのみ認められた。今回の知見は、GJが神経幹細胞の増殖・分化のコントロールに重要な役割を果たしていることを示したものである。
以上、mitogen(FGF)とanti-mitogen(OCT)が組織発生において果たす役割について、組織培養を用いて定量的に検討した点が重要な功績であると考える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,900千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】09670834 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大脳皮質 / マウス / 細胞分裂 / β-FGF / Gap Junction / Octanol / 成長因子 / 分化 / 大脳皮質発生 / 細胞周期 / 組織培養

【研究成果の概要】

各種成長因子が神経系幹細胞の細胞分裂動態に及ぼす影響を検討するため、平成9年度に大脳皮質の組織培養法を確立した。すなわち胎生13日のマウスの大脳半球より、先端を鋭利にしたガラス製毛細管を用いて大脳壁をパンチアウトし、コラーゲン中でDMEMを用いて培養した。BUdRによるcumulative labelingの結果、Gl期の長さは6.3-8.3時間、Growth Fractionは0.73という結果を得た。
平成10年度には、脳の発生において特に重要な役割を果たしていると考えられるβFGFの細胞周期に及ぼす影響を検討した。また、Gap Junctionの阻害剤である1-Octanol(OCT)を培養液中に加え、分裂動態に及ぼす影響を検討した。これはGap Junctionが分裂上皮の幹細胞同士を結合、細胞周期のレギュレーションに重要な役割を果たしているという知見に基づくものである。また、すべての実験を大脳外側(Area40に相当)でも行い、発生段階の違い(外側が内側に比して約24時間先行)とFGF、OCTの作用の関係について検討した。
すべての系においてGrowth Fraction(GF)がin vivoの1.0という値に比して明らかに低いのは、おそらくQ Fractionの細胞が脳室層内に留まっているためと考えられる(平成9年度実績)。したがってArea40におけるFGF、OctanolによるGFの更なる低下は、Q Fractionの増加(分化の誘導)を反映していると考えられる。一方、Gl期の長さに関しては、Area1、Area40ともにFGF、Octともに効果は認められなかった。今後は、分化が進行した部位(Area40)におけるFGFのQ Fractionに及ぼす影響について、検討を進める予定である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)