【研究領域課題番号】21K19201 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA-タンパク質複合体 / クライオ電顕 / 構造解析 / RNA / タンパク質

【研究成果の概要】

ＲＮＡは多岐にわたる重要な役割を担う生体高分子化合物である。多くの場合、ＲＮＡはパートナー蛋白質と複合体を形成することにより複雑な生体反応を実現している。そのため、ＲＮＡの機能を理解するにはＲＮＡと蛋白質の複合体の構造を原子レベルで明らかにすることが鍵となる。本研究では、ＲＮＡ配列をリボソームＲＮＡに挿入して表面に露出させ、ここに結合するタンパク質を結合させることにより、「ＲＮＡ-蛋白質複合体」をリボソーム表面に形成させ、これを丸ごと構造解析する技術を開発することにより、ＲＮＡ科学の研究領域を加速することをめざす。２０２１年度は、立体構造に基づきリボソーム上のＲＮＡの挿入部位を検討し、５箇所のＲＮＡループ領域を選出した。さらに、これらの部位に目的のＲＮＡ配列を挿入した変異リボソームを作成した。リボソームＲＮＡ遺伝子の欠損大腸菌に任意の配列のリボソーム遺伝子を乗せたプラスミドを導入し、これを培養することで変異リボソームを調製した。いずれの設計においても良好に大腸菌は生育し、設計に問題がなかったことが確認できた。また、挿入したＲＮＡに結合するタンパク質を調製した。大腸菌発現系を用いて、３種類のタンパク質を可溶性分子として大量発現させた。２つのタンパク質については良好に発現したが、一つについては発現量が少なく、また、大腸菌内のＲＮＡと強く結合しており、十分な量の試料を得ることができなかった。今後、試料調製法を検討する必要がある。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2021-07-09 - 2023-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】19H03164 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自然免疫 / TLR受容体 / クライオ電子顕微鏡 / タンパク質 / 構造解析 / シグナル伝達 / 膜受容体

【研究成果の概要】

自然免疫受容体のTLR全長に関して構造生物学的研究を進めた。TLR3全長をナノディスクに再構成した試料についてクライオ電子顕微鏡構造解析に成功した。細胞外ドメインの密度は明瞭に観察されたが、膜貫通領域および細胞内のTIRドメインは解像されなかった。核酸認識TLRの局在を制御するUNC93B1とTLR3およびTLR7の複合体の構造解析に成功し、UNC93B1による核酸認識TLRの局在制御機構の構造基盤を明らかにした。

【研究の社会的意義】

種々の病気の治療薬開発のターゲットであるTLR受容体に関して構造生物学的な研究を進めた。TLR全長の活性化機構の全貌はいまだ明らかになっておらず、本研究は今後の研究の基盤となることが期待される。一部のTLRの細胞内局在を制御するUNC93B1とTLRの複合体の構造解析に成功し、TLRの細胞内局在を制御する薬剤開発の構造基盤を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究領域課題番号】19H02519 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘモシアニン / 電子顕微鏡 / 構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / タンパク質包摂

【研究成果の概要】

種々のリンカーを介してゲストタンパク質をヘモシアニン内部に結合させることができた。また、リンカーの違いにより、ゲストの結合がホストの１０量体構造の維持に及ぼす影響が異なることがわかった。これは、ゲストがホスト内部に結合する強さに起因することが示唆された。電子顕微鏡観察からも、条件を整備することで、内部にゲストを包摂したまま安定な１０量体構造を維持できることがわかった。金ナノ粒子を用いた評価からは、ゲストの包摂率を向上させることの重要性が示唆された。

【研究の社会的意義】

著しい発展を遂げているクライオ電顕単粒子解析であるが、100 kDa以下の小さな蛋白質や形状に際立った特徴のない蛋白質の解析は依然として難しく、あらゆる蛋白質の構造を容易に決定できる手法の開発を望む声は大きい。ヘモシアニンをゲストに用い、その開発を目指した本研究で得られた知見、すなわち、ホストの会合構造がゲストを結合させるリンカーの種類により異なることや、ゲストの包摂率を向上させることの重要性が、今後の技術開発に寄与することが期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究領域課題番号】18K05314 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造解析 / 蛋白質ケージ / Scaffold / クライオ電顕 / scaｆfold / scafold

【研究成果の概要】

本研究では、高い熱安定性・pH安定性を有する蛋白質ケージ（Scaffold）のもつ直径約8nmの内部空洞に標的蛋白質を閉じ込め、粒子画像抽出が容易なScaffoldごとクライオ電顕単粒子解析法によって立体構造を決定すること、そのために必要な技術基盤を構築することを目的としている。
現在までに、モデル分子を用いて発現ベクターの構築から、精製、電顕観察、画像解析までを繰り返し、必要な技術基盤開発を行っている
Scaffold蛋白質と標的蛋白質の発現量を調節し効率よくScaffold-標的蛋白質複合体を形成させることは可能となった。また、適切な精製タグを用いることでScaffold-標的蛋白質複合体を高純度で精製することに成功した。
しかし、構造解析を行うとScaffoldの構造は比較的高分解能で決まるものの、標的蛋白質はScaffold内部で様々な方向を向き本研究のめざす分解能の構造が得られていない。そこで、Scaffoldと標的蛋白質を繋ぐリンカーを種々のαヘリックス形成配列に置換し、標的蛋白質を含まないケージを作成し結晶構造解析にて評価した。ところが、ケージの高い対称性と異なる対称要素を持つため、もしくは期待した硬い構造を形成できないために、いずれの場合もリンカー部分の電子密度を観察できなかった。そこで、Scaffold外側に画像平均化のための目印となる蛋白質を付加することで、Scaffold-標的蛋白質複合体の構造解析を容易にするような方法で解決しようとしている。
また、内部空洞の小さい蛋白質ケージを用いた標的蛋白質の固定化も継続して行っている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10558106 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

電子線回折 / 結晶解析 / 構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / 低温試料ホルダー / 蛋白質結晶 / データ収集

【研究成果の概要】

本研究では、X線結晶解析にかからないような薄い結晶からでも蛋白質の構造決定を行えるよう、電子線回折用回転カメラとその関連技術の開発を目標とした。生物学的に重要な膜蛋白質では特に数層しかない結晶が得られることも多いからである。この目的のために、(i)既存の電子顕微鏡の大幅な改造、(ii)コンピューター制御ソフトウェアの開発、(iii)高傾斜角低温試料ホルダーの開発を行った。また、同時に、電子線回折パターンの指数付、反射点の積分強度の計算回折強度のスケーリングのためのソフトウェアの開発も行った。このような開発は、数層から成る結晶の場合、X線回折にはかからないことと、回折パターンは三次元結晶からのものとして扱わなければならないが既存のX線結晶解析用ソフトウェアでは処理できないためである。
回転カメラの最初のものは、DCモーターと内蔵ロータリーエンコーダー、スロースキャンCCD検出器を用いて実現された。これは、大幅な改造を必要とするわけではないので、現代の電子顕微鏡の大部分のものに設置可能である。このシステムの性能を検定するため、カルシウムATPaseの超薄結晶に適用し、傾斜角±30°までのデータを収集した。本研究で開発した「最低電子線量電子線回折法」を用いることにより、100枚もの回折パターン(回転写真)を同じ結晶から得ることが出来るようになった。さらに精度を上げるために、第2のものを作製した。これはハイデンハイン社の高精度ロータリーエンコーダーとパルスモーターを用いたものである。ハードウェアは完成したが、制御ソフトウェアは未完成の部分を残している。しかしながら、これまでに得られた予備的結果は大変期待が持てるものである。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】11,400千円 (直接経費: 11,400千円)