【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】14370063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘムオキシゲナーゼ / 一酸化炭素 / 可溶性グアニル酸シクラーゼ / 一酸化窒素 / 遺伝子改変動物 / シスタチオニンベータシンターゼ / シスタチオニン合成酵素 / 硫化水素 / アミノ酸置換体 / ノックアウト動物 / heme oxygenase / cystathionine β synthase / 胆汁分泌 / microcirculation / heme oxgenase / carbon monoxide / nitric oxide / hypoxia / soluble guanylate cyclase / conditional knock out mice / cystathionine beta synthase

【研究成果の概要】

ヘムを一酸化炭素(CO)、鉄およびビリベルジンに分解するヘムオキシゲナーゼ(HO)は多彩な生物活性を有していることが知られているが、HOアイソザイム固有の生理活性の発現とその調節機構、COにより制御される標的分子の検索、さらに生体内で産生される他のガス分子との相互作用について未だその全貌が解明されていない。本研究課題では、HOアイソザイム発現とCOなどの反応生成物を介した生物作用発現との関係を明確に議論できる実験系を確立し、本酵素活性の生体制御における病態生理学的意義について解析することを目的としてきた。この目的遂行のために、既に報告のあるHO遺伝子欠損で認められる繁殖不全を回避できるOre-LoxPシステムに基づいた新しいコンディショナルノックアウトマウスの作成に着手し、現在までに目的とした相同組換えを起こしたES細胞を用いてキメラマウスの作成に至っている。次に、COにより特異的に作動する新規細胞内レセプタの検索を行うために、COにより惹起される細胞内代謝変動をCE-MSを用いて解析した。その結果、アセトアミノフェン投与による肝臓内CO産生増加に伴い、肝臓内メチオニンの増加とS-アデノシルメチオニンおよびシステインからグルタチオンやタウリンに至る代謝経路の抑制が認められた。この結果より、メチオニンからシステイン合成に至る含硫アミノ酸代謝経路に存在するcystathionine β-synthase(CBS)がCOの新しい細胞内標的分子であることが明らかになってきた。また、CBS精製蛋白を用いてCOによる酵素活性阻害様式を解析した結果、数mMのCOによりCBS活性阻害が認められるがこれはヘムの2つの軸配位子のうちシステイン残基がCOと置換することで生じることが明らかになった。さらに我々はCOと別の内因性ガス状メディエータである一酸化窒素(NO)と生体内における相互作用について解析した結果、網膜組織内において両者の既知標的分子である可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)活性を局所で産生されるCOとNOが協調して制御しており、このCOによるsGCの活性制御は局所のNO濃度に強く依存していることが明らかになった。本研究期間でHO-CO系を介した新たな生物活性を見出すことが出来たが、今後我々が取り組んでいる新規遺伝子改変動物の利用により更なるHOの生物学的意義の解明を行う必要があると考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】11,200千円 (直接経費: 11,200千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】13680850 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

soluble guanylate cyclase / carbon monoxide / nitric oxide / retina / Muller cell

【研究成果の概要】

Soluble guanylate cyclase (sGC)は、細胞内second messengerであるcGMPの生成反応を触媒するヘム酵素である。その酵素活性はNOやCOによって増強されることが報告されているが、両ガス分子が共存するin vivoでの本酵素の活性調節機構については不明な点が多い。COがNO依存性sGC活性化をsynergisticにあるいは逆にantagonisticに制御するかは長い間論争の的であった。そこで本研究では、sGC活性化に伴う構造変化を認識する抗sGC単クローン抗体(mAb3221)を用いた免疫組織化学的メカニスティックプロービングという全く新しいアプローチにより、ラット網膜組織におけるsGCによるin vivoガスセンシングの空間的解析を試み、生体内でのNO・COの制御分子としての役割を考察した。
ラット網膜という組織学的に層を構成する細胞種の同定が容易である実験系の選択がもたらした最大のメリットは、シグナル分子であるCO・NOとそのセンサー蛋白のsGCの相互作用が一組織内であるにもかかわらず、一面的でなく多面的に捉えられたことである。ハウスキーピングレベルのCOを抑制すると、網膜全層にわたるhomogeneousなsGC活性化が起きるのに対して、NOを抑制した状況下でのCO抑制はheterogeneousであり層特異的であることが判明した。つまりexternal limiting membrane (ELM)とoptic fiber layer (OpFL)では、内因性のCO抑制によってNO単独阻害による抑制に加えてさらなるsGC活性減少が起きるが、一方inner nuclear layer (INL)とinner plexiform layer (IPL)ではこのような相加的な減少は示されない。
COに対するこのようなheterogeneousな反応性のメカニズムのkeyとなるのは局所のNO availabilityであるという仮説のもとにin vivo実験系でさらなる検証をした。ウシ肺から精製したsGC精製標品を用い、CO存在下・非存在下でNO donorであるS-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP)によるsGC活性を測定した。反応溶液中にCO(10-30μM)が存在するとSNAPの濃度が低い範囲ではsGC活性は促進され、逆にSNAPの濃度が高い範囲では抑制された。このデータはCOがNOによるsGC活性化の行き過ぎを抑制する一方、NOの低い状況下ではsGC活性化を介して基礎cGMP量を確保するためのagonistと働く可能性を示唆するものであり、我々の仮説を支持するものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)