Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

化石タンパク質 / 分子化石 / 腕足動物 / 分子古生物学 / 分子進化学 / 質量分析 / 硬骨格プロテオーム / バイオミネラリゼーション / 貝殻基質タンパク質 / 外套膜 / 殻体プロテオーム / 結晶内タンパク質 / 殻体基質タンパク質 / アミノ酸ラセミ化 / アミノ酸配列 / 分子進化 / 硬組織

化石タンパク質のアミノ酸配列を決定する前段階として、現世腕足動物の殻体プロテオーム解析と外套膜トランスクリプトーム解析をLaqueus rubellusとCoptothyris grayiの2種について行った。その結果、74種の殻体タンパク質を同定し、これまでに他の動物門で知られる殻体タンパク質と相同ではない新規タンパク質が大部分を占めることを解明した。一方、約39万年前のL. rubellus、C. grayiの化石タンパク質の予察的解析も行い、殻体内の大部分のアミノ酸がペプチド内ではなく、遊離の状態で存在しており、アミノ酸配列を得るためには、化石抽出物の濃縮が必要であることを明らかにした。

TGF-β / シグナル伝達 / 蛋白質間相互作用 / マススペクトロメトリー / Smad / DNAP / 骨形成因子 / 構造決定 / 質量分析 / アミノ酸配列

蛋白質-蛋白質間の相互作用による細胞内シグナル伝達機構を明らかにするためにSmadに結合する蛋白質をマススペクトロメトリーで同定することを目的として実験を行った。Smad1〜8にFla-tagをつけたコントラクトを作り哺乳類細胞にトランスフェクションした。ついでアガロースピーズに結合した蛋白質をFlag抗体を用いて免疫沈降し、共沈する蛋白質を銀染色したSDS-PAGEから切りだし、トリプシン処理したのち、マススペクトロメトリーによってペプチドの質量を測定した。その結果、Rabファミリーのタンパク質がSmad1と結合することが明らかとなった。
Smad3はCAGAというモチーフに活性化された時にのみ結合することから、CAGA sequenceを用いてDNA affinity purification (DNAP)によるSmad3の回収を試みた。その結果、HaCaT細胞ではSmad3はTGF-βによって活性化されたときにのみ特異的にCAGA sequenceに結合し、さらにSmad2も共沈することが確認された。また転写共役因子であるp300やc-SkiがSmad3とともに回収できることが確認された。
結合タンパク質の特異的な回収のためにはPoly d(1-C)の濃度の決定、ビーヅの洗浄の条件、DNAとの反応時間の設定などが重要であることが確認された。またダイナビーヅを用いることによって、タンパク質を銀染色で調べた場合、劇的にバックグラウンドが低くなることが明らかとなった。以上からDNAPを用いることによって細胞内に存在するSmad結合タンパク質を活性化された時に特異的に効率良く回収できることが明らかとなった。

【研究分担者】
高尾敏文	大阪大学	蛋白質研究所	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
今村健志	癌研究所生化学部	主任研究員	(Kakenデータベース)