Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

中枢神経細胞 / 神経生理学 / 超短パルスレーザー / ケイジド試薬 / グルタミン酸 / 受容体 / 生理学 / 2光子励起顕微鏡 / スパイン / 高性能レーザー / カルシウム / イメージング

これまでケイジドグルタミン酸を2光子励起法で活性化する手法により、海馬錐体細胞において、機能的AMPA受容体発現とスパイン形態に強い相関があることを見出してきた。そこで本研究において、可塑性に重要な役割を果たすNMDA受容体の機能と、スパイン形態との間の関係性を調べることを行った。実験方法としては、海馬錐体細胞にホールセルを行い、低親和性カルシウム指示薬と、細胞形態を同定するためのAlexa594をロードした。これはカルシウム指示薬によるカルシウム動態の影響を少なくするためである。細胞外液のマグネシウム濃度を減らした状態で、任意のスパイン部位に対して、2光子励起によってケイジドグルタミン酸を活性化した。その結果誘発される単一スパインにおけるNMDA受容体を介したカルシウム濃度上昇を、2光子励起顕微鏡を用いて、高速ラインスキャンを行ってイメージングした。Alxa594の蛍光に対するカルシウム指示薬の蛍光比によってカルシウム濃度変化を捉えた。この方法によって、一定刺激の条件でのスパイン内カルシウム濃度変化の絶対値を求めることができるようになった。カルシウム濃度上昇は、レーザー出力の2乗に比例し、あるところで飽和することから、スパイン頭部のNMDA受容体を2光子励起法によるグルタミン酸投与によって刺激できることを実証した。また1.5マイクロメートル以上離れたスパイン間では互いに刺激が干渉せず、個々のスパインだけの反応を得られることがわかった。NMDA受容体電流及びカルシウム濃度上昇は、AMPA受容体に比べ、ノイズが高いため、同一スパインにおいて3回刺激し、それを平均化することでCVの低い値を得ることができた。

カルシウム / ケイジド試薬 / 膵臓腺細胞 / 開口放出 / パッチクランプ / アセチハコリン / 分泌顆粒 / カルシウム(Ca) / 外分泌腺 / イオンチャネル

本研究ではケイジド試薬を利用して外分泌腺細胞の分泌機能を解明することを試みた。局所的ケイジド試薬活性化や、その他いろいろな事を試みた結果、特に、冷却CCDカメラとケイジド試薬を用いた研究において以下の様な著しい研究成果がでた。
1)外分泌腺細胞において、アゴニストによる細胞内ストアからのCa放出で分泌の起きている局所でCa濃度が10μモルに達する事を低親和性Ca指示薬と冷却CCDカメラを用いて初めて見出した。2)新たに見つかったマイクロモルのCa上昇は外分泌腺の開口放出に必須であることがわかった。3)これに対して、低濃度のCa上昇はCa依存性イオンチャネルの活性化しか起こさない。この様に、マイクロモルのCa上昇には低濃度上昇とは別の大きな機能的意義があることがわかった。4)低親和性Ca指示薬と高親和性Ca指示薬を共用する4波長画像処理法を開発し、腺細胞先端部トリガ性ゾーンでCaドメインと呼ばれる高濃度Ca領域がある事を見出した。5)神経終末ではこのCaドメインは伝達物質放出に決定的な意義を持っていることが想定されているが、外分泌腺の開口放出では、Caドメインは寄与しないと考えられた。これは、外分泌腺の分泌顆粒のCaセンサーのCa結合が遅いためである。この様に、Caドメインの細胞機能への関与の違いを論証したのはこの仕事が初めてである。これらの結果については現在論文を投稿中である。