【研究領域課題番号】18H01323 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

形態形成 / 軟体動物 / 進化発生学 / 貝殻形成 / らせん成長 / バイオミネラリゼーション / 貝殻基質タンパク質 / プロテオーム / 左右性 / 進化 / 進化発生 / 表現型可塑性 / DNAメチル化 / 水流実験

【研究成果の概要】

本年度は以下の4つの項目の研究を主に行った。(1)軟体動物の貝殻基質タンパク質(SMP)の分子進化学的研究、(2) Wnt遺伝子の貝殻形成への関与の分析、(3)クサイロアオガイ（Nipponacmea fuscoviridis）胚への遺伝子導入の技術開発、（４）L. stagnalisのSMP遺伝子の発現非対称性を利用した貝殻形成で重要なSMPの同定。(1)では軟体動物におけるZona pellucidaドメインを含むSMP(EGFZPとE G F L)の構造、機能、進化の解析と、頭足類のオウムガイに含まれるSMPのプロテオーム解析を行い、前者ではEGFZPが他のSMPsと相互作用できることとEGFLがカルサイトの貝殻の進化に関連している可能性が高いことを解明した。後者ではオウムガイが独自のSMPを持つとともに、SMPに含まれるドメインについては、頭足類以外の分類群のSMPと共通するものが多く見られることを明らかにした。(2)では胚をWnt促進剤で処理することで生じた変異個体をCTスキャンで撮像し、それを元に貝殻成長モデルにおけるパラメータ推定を行った。(3)では、lophotrochinとengrailedの2つの遺伝子をターゲットにCRISPR/Cas9のコンストラクトを作成し、受精卵への顕微注入を行った。処理した胚よりDNAを抽出し、PCR/シーケンシングを行うことで、lophotrochin遺伝子においてゲノム編集が起きていることを確認した。(4)では、L. stagnalisの右巻系統と左巻系統の交雑と再度の分離によってゲノムを均一化した左右系統それぞれ3個体ずつを用いて、外套膜をそれぞれ前後左右に4分割し、それらの（合計24個の）トランスクリプトームデータを得た。現在それらの比較を行い、前後や左右に特異的に発現する遺伝子の特定を進めている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】層位・古生物学

【研究領域課題番号】23244101 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

貝殻形成 / 軟体動物 / 形態形成 / 進化発生学 / バイオミネラリゼーション / 比較ゲノム / 貝殻基質タンパク質 / 冠輪動物 / トランスジェニック生物 / in vivoタンパク質機能解析 / bmp遺伝子 / レチノイン酸 / 貝殻タンパク質 / アコヤガイ / ゲノム / 形態進化 / らせん成長 / 遺伝子組換体

【研究成果の概要】

軟体動物の貝殻形成機構を解明するため、巻貝類のモノアラガイ、セイヨウカサガイ、クサイロアオガイ、二枚貝類のアコヤガイ、および頭足類のオウムガイ等を用いたゲノム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析を行うとともに、胚への遺伝子導入技術の開発や各種阻害剤による遺伝子産物の機能解析を行った。その結果、貝殻の初期発生に関連した遺伝子経路と貝殻成長における巻きと捩れを制御するタンパク質を発見したほか、貝殻基質タンパク質を網羅的に同定し、それらの機能や進化プロセスを推定するとともに、軟体動物における遺伝子導入実験系を確立するなどの成果を得た。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】49,660千円 (直接経費: 38,200千円、間接経費: 11,460千円)

【研究分野】環境農学

【研究領域課題番号】22228006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

海洋生物 / 石灰化 / 地球環境保全 / 電子顕微鏡観察 / 二酸化炭素 / 有機基質 / 有機無機相互作用 / 結晶多形 / 基質タンパク質 / バイオミネラリゼーション / その場観察 / 温室効果ガス / サンゴ / 軟体動物

【研究成果の概要】

海洋生物の中でもサンゴや円石藻など代表的な石灰化生物の石灰化組織に存在する微量の有機物を抽出・精製し、それらの構造と石灰化における機能を明らかにすることによって石灰化機構の解明を試みた。その結果、10種を超える新規タンパク質および既知化合物を同定し、天然物および組換え体を用いた機能解析や電子顕微鏡観察から、石灰化における生物種を超えた有機基質の存在部位と役割に関する共通のモデルを提案した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】152,750千円 (直接経費: 117,500千円、間接経費: 35,250千円)

【研究分野】層位・古生物学

【研究領域課題番号】15104009 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

進化 / 発生・分化 / 動物 / ゲノム / 遺伝子 / バイオミネラリゼーション / 形態形成 / 軟体動物 / 貝殻形成 / 発生進化学 / 発生遺伝学 / Lymnaea

【研究成果の概要】

本計画では,(1)貝殻形成のマスター遺伝子,(2)貝殻分泌の制御因子,(3)貝殻の左右非対称性の制御因子の単離・同定と機能の解明を通して,貝殻の進化過程や進化機構を考察することを目的とした研究を行い,以下の成果を得た.
(1) 殻体形成のマスター遺伝子
転写調節因子engrailedと分泌成長因子dppのモノアラガイでの相同遺伝子の発現パターンを調べた結果engrailedは他の軟体動物と同様に貝殻腺の周縁において発現している一方で,dppはカサガイとは異なり,陥入している貝殻腺の右側で発現していることを発見した.
(2) 貝殻分泌の制御タンパク質
モノアラガイを含む有肺類8種から貝殻基質タンパク質ダーマトポンティンを同定して系統解析を行い,有肺類の中で少なくとも2回独立に遺伝子重複が起きたこと,化石記録との比較からその重複は中生代以降に起きたことを明らかにした.また,アコヤガイでは,著しくアスパラギン酸に富んだ超酸性貝殻基質タンパク質アスペインの構造を明らかにし,アスペインがカルサイトの選択的沈殿の制御因子であることを発現パターンの解析とin vitroの結晶成長実験によって示した.
(3) 巻貝の巻きの制御因子
モノアラガイの左巻き個体の外套膜の左側と右側で非対称的に発現している遺伝子をHiCEP法を用いて網羅的に探索し,合計11588個の遺伝子が外套膜で発現していること,また左右で発現量が有意に異なる遺伝子が数十に及ぶことを示した.左右で大きな変動を示す20個の遺伝子について,その構造と機能の解析を継続して行っている.

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2003 - 2007

【配分額】106,210千円 (直接経費: 81,700千円、間接経費: 24,510千円)

【研究分野】層位・古生物学

【研究領域課題番号】11440153 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

殻体形成 / 形態形成 / バイオミネラリゼーション / 軟体動物 / Lymnaea / 貝殻タンパク質 / Hox遺伝子 / 発生工学 / 貝殼タンパク質 / バイオシネラリゼーション / MSP-1 / 殻内タンパク質

【研究成果の概要】

Lymnaeaの発生遺伝学的解析の基礎的データを得るため,受精卵からの発生各ステージの固定標本を作成し,組織学的観察を行った.また,最初の殼(原殻)が形成される前後の幼生ステージ,および成体の外套膜,筋肉,中腸腺より抽出したmRNAからそれぞれcDNAライブラリーを作成した.殻体の基質タンパク質についてはSDS-PAGEによる解析を行い,3種類のタンパク質を分離した.外套膜の左右でサブトラクションクローニングを行った結果,外套膜の外側(左巻き個体の左側)に特異的に発現している2つの遺伝子断片(LM11,LM24)の単離に成功した.LM11は,P-typeのATPaseであり,Ca^<2+>の能動輸送への関与が示唆される.LM24は,Zn-fingerドメインを持つ転写因子である(Endo et al.,2002).また,これらの遺伝子の機能を逆遺伝学的に解析するため,Lymnaea受精卵へのマイクロインジェクションの基礎的実験も行った.現在,RNA干渉法による解析の準備を進めている.一方,ホタテガイで単離されたMSP-1の配列を基に,同一殻体内にカルサイトとアラゴナイトという2種類の炭酸カルシウム結晶多形を有するアコヤガイにおいて,同様の部分配列を持つタンパク質Aspeinを単離した.Aspeinは,60%がアスパラギン酸から成る特異な基質タンパク質で,カルサイト殻層での特異的な発現が確認された.これにより,生体鉱物における結晶多形制御のメカニズム(カルサイト-アラゴナイト問題)という長年来の難問の解決の糸口が得られた(投稿中).

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2002

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)

【研究分野】層位・古生物学

【研究領域課題番号】09740386 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

殻体形成 / 軟体動物 / 硬組織 / 殻内タンパク質 / 形態形成 / バイオミネラリゼーション / 有機-無機相互作用 / 分子発生学 / 有機マトリックス / 結晶成長

【研究成果の概要】

本年度は,実験に共する巻貝類を選択するため,淡水生の複数種について予備的な飼育実験を行い,世代時間および初期発生における殻体成長の観察を行った.また軟体動物の殻体形成に大きく関与していると考えられる因子として,二枚貝類(ホタテガイ:Patinopectenyessoensis)の殻に含まれる主要な水溶性酸性タンパク質(MSP-1)の構造解析を行った.まず生化学的な方法により殻内の有機物を粗調整し,SDS-PAGEによって精製分離したタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列をペプチドシーケンサーにより決定し,これをもとに当該タンパク質をコードする相補的DNAを増幅・クローン化し,塩基配列を決定することによりMSP-1の全アミノ酸一次配列を決定した.その結果,このタンパク質が主にアスパラギン酸,グリシン,セリンの組み合わせから成る3種類の領域が規則的に繰り返した特徴的な構造を持つことがわかった.さらに,MSP-1の機能上重要と思われるアスパラギン酸が多く含まれる酸性領域において,アスパラギン酸が従来の予測とは異なる並び方をしていることを発見した.また,ノザンブロットハイブリダイゼーションにより,当該タンパク質をコードするmRNAのサイズ,およびそれらが外套膜で発現していることを確認した.現在,MSP-1が軟体動物でどれだけ広く保存されているかについて,PCR法を用いて検討を進めている.

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】層位・古生物学

【研究領域課題番号】09304049 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

軟体動物 / 起源 / 系統 / 進化 / 初期発生 / 形態形成 / 分子生物学 / バイオミネラリゼーション / 生体鉱物学 / 分子系統学 / 生鉱物学 / 古生物学

【研究成果の概要】

1.比較解剖学・発生学的研究
二枚貝類に関する研究:棚部は指導学生の早風と共同で、現在二枚貝ムラサキガイの幼生殻形態を走査型電子顕微鏡を用いて観察し、二枚の石灰質の殻の形成に先行してトロコファー幼生中期に楕円形の一枚の有機質の原殻Iが最初に形成されることを確認した。有機質でできた1枚の楕円形の殻は、他の軟体動物単の発生初期にも確認されることから、貝殻亜門の共有派生形質の一つと解釈される(Hayakaze & Tanabe,1999)。
頭足類に関する研究:棚部は鳥羽水族館の内山公夫氏と共同で、原始的軟体動物頭足類オウムガイの初期胚殻の形態・構造が鞘形類やアンモナイト類のものと大きく異なり、むしろ原始的軟体動物の単板類と類似性があることを明らかにした(Tanabe & Uchiyama,1997)。また、棚部と伊佐治はオウムガイの中期胚の体管組織を透過型電子顕微鏡を用いて調べて、外套膜原基が原殻の内面に付着することにより体管が形成されることを明らかにした(Isaji & Tanabe,in prep.)。さらに、棚部・佐々木は内外研究者と共同で頭足類の口球部器官、アンモナイト類の筋肉痕および体管の比較解剖学的特徴を記載し、系統学的意識を考察した(Tanabe et al.,1998;Tanabe & Fukuda,1999;Tanabe et al.,in press.)。
2.分子系統学的研究
遠藤と上島は、腕足動物の系統上の位置を明らかにすべく、ホウズキチョウチンのミトコンドリアDNAのゲノム構造を明らかにするとともに、遺伝子マップの決定されている他の動物門との比較を行った。その結果、腕足動物は前口動物の中でも環形動物と遺伝構造の類似性が高いことがわかった。さらに、他の研究者の成果を含めて総合的に検討した結果、軟体動物、腕足動物、環形動物からなるクレードでは、まず軟体動物の祖先が分岐し、ついで腕足動物と環形動物の祖先が分岐したという系統仮説が推定された(Noguchi et al.,in press)。
3.生鉱物学的研究
軟体動物における殻体形成の機構と起源を明らかにするため,遠藤は大学院生の更科と共同で、二枚貝ホタテガイの殻に含まれる主要な水溶性タンパク質(MSP-1)をコードする相補的DNAをクローン化し,MSP-1の全アミノ酸一次配列を決定した.その結果,このタンパク質が主にアスパラギン酸,グリシン,セリンの組み合わせから成る3種類のドメインが規則的に繰り返した特徴的な構造を持つことがわかった(Sarashina & Endo,1998).さらに,ドメインにおけるアスパラギン酸の配置の規則性と保存性に基づき、このドメインが方解石の特定の結晶面と特異的に相互作用して葉状結晶が形成されるという仮説を提唱した(Sarashina & Ebdo,in prep.)。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】28,800千円 (直接経費: 28,800千円)