【研究分野】生態・環境

【研究領域課題番号】16H04840 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シロアリ / 共生 / 腸内微生物 / 原生生物 / セルロース / 進化 / 昆虫 / 腸内微生物群集 / セルラーゼ / 木質分解

【研究成果の概要】

シロアリの餌である木片の消化の大部分は、シロアリと1.5億年以上前に共生を開始した腸内原生生物群集が担っているが、それら原生生物の起源や共生に至った過程は未知である。本研究の主目的は、木質分解性原生生物を進化過程で喪失した「高等シロアリ」の一系統群が比較的最近、新規な木質分解性原生生物を再獲得した可能性の検証である。結果、新規原生生物は多様な高等シロアリに共生しているものの、多数の原生生物細胞が見られるのはやはり一系統群のみであること、同原生生細胞質が木片で充満していること、同原生生物を含む腸画分はセルロース分解活性を有することなど、今後の研究の基盤となる重要な情報を得ることができた。

【研究の社会的意義】

本研究では、比較的最近、新規に獲得されたと見られるシロアリ腸内微生物を題材とし、その系統と多様性、セルロース分解活性などを明らかにした。シロアリは木材の大害虫であるとともに、自然界では重要な分解者であり、その生理・生態の解明は基礎・応用科学の両面で重要である。本研究により、シロアリが腸内共生微生物を獲得する進化過程の一部が解明され、今後のシロアリ研究の基盤となる情報を得ることができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】木質科学

【研究領域課題番号】24380089 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオマス / βーグリカナーゼ / セルラーゼ / キチナーゼ / 結晶性多糖 / セルロース / キチン / プロセッシビティ / 糖化 / グリカナーゼ

【研究成果の概要】

セルロースやキチンは未利用バイオマスの主成分であり、食料と競合しない次世代の炭素源として有効利用が望まれている。これらは、β－グリコシド結合を有する不溶性多糖であることを共通の特徴として有していることから、いかにβ－グリコシド加水分解酵素を固液界面で効率良く働かせるかが、未利用バイオマスを高効率に変換するための鍵であると言える。
本研究では、固液界面における糸状菌由来のセルラーゼの挙動、細菌由来のセルラーゼおよびキチナーゼなどのβ－グリカナーゼの挙動を高速原子間力顕微鏡を用いて定性的・定量的に評価し、未利用バイオマスの糖化という次世代の生化学的プロセスを高効率化するためのストラテジーを構築した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】環境農学

【研究領域課題番号】21688023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

セルラーゼ / セルロース / 高速原子間力顕微鏡 / 固液界面 / セロビオヒドロラーゼ

【研究成果の概要】

セルロースを分解する酵素(セルラーゼ)分子が、セルロース表面で「渋滞」を起こすことで、セルロースの分解効率を下げている様子を、高速原子間力顕微鏡によって直接観察することに成功しました。本結果は、「分子が渋滞する」という基礎科学的に新規な知見であるだけでなく、セルロース系バイオマスから液体燃料やプラスチック原料を高効率に生産するシステム構築にも重要な指針を与えます。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】21,840千円 (直接経費: 16,800千円、間接経費: 5,040千円)

【研究分野】環境農学

【研究領域課題番号】19688016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオマス / セルラーゼ / 糖酸化酵素 / セルロース / 酸化還元反応 / 固液界面 / セロビオース脱水素酵素 / リアルタイムモニタリング

【研究成果の概要】

本研究では、糖酸化酵素による活性検出法の感度の高さを利用し、これらの酵素に酸化還元電極を組み合わせることで、これまでの光学的手法では活性検出が不可能であった固体基質に対する酵素活性を、リアルタイムにモニタリングする手法を開発することを目的とした。2007年度は、メディエーターを用いた間接法によって、酸化還元電極を用いたセルラーゼ活性のリアルタイムモニタリングに成功し、さらに2008年度はメディエーターを介さない直説法によるセルラーゼ活性の測定にも成功した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】23,010千円 (直接経費: 17,700千円、間接経費: 5,310千円)

【研究分野】林産科学・木質工学

【研究領域課題番号】17658075 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

セルロース / 生分解 / 酸化酵素 / セルラーゼ / 1級水酸基 / セロウロン酸 / リアーゼ / 加水分解酵素

【研究成果の概要】

セルロースの生分解機構については、セルラーゼによる加水分解のみが知られており、関連して多くの研究が進められている。一方、本研究では、セルロースの1級水酸基であるC6位の水酸基の酵素酸化がまず起こって親水性のカルボキシル基が導入され、続いてヒドロラーゼ型およびリアーゼ型の酵素によって低分子化、更に代謝されるという全く新しいセルロースの生分解ルートの存在を証明し、その機能と役割を解明しようとするものである。昨年度から、微結晶セルロース粉末(高結晶化度の天然セルロースI型の結晶構造)および銅アンモニア溶液から再生したセルロース(低結晶化度のセルロースII型の結晶構造)をイオン交換水中、市販セルラーゼで処理し、水可溶成分あるいは水不溶のセルロース残渣成分中に二重結合を有するヘキセンウロン酸基の存在の有無を検討してきた。滅菌が不完全なセルロース分散液を市販セルラーゼ処理した場合には、二重結合の存在を示すデータが得られたが、菌の混入による副反応の可能性があった。そこで、完全に滅菌した試料で市販セルラーゼ処理したところ、水可溶成分には二重結合の存在は認められなかったが、水不溶のセルロース残渣部分に二重結合の存在を示唆する結果が得られた。この結果の再現性を現在検討している。二重結合の存在が認められれば、セルロースの新しい生分解機構として、C6位の酸化に続いてリアーゼによるβ脱離型の分解が存在することになる。市販セルラーゼ処理残渣中の二重結合の存在は、クロマトグラフによる検出(250nm付近にヘキセンウロン酸基の二重結合由来の吸収が現れるはずなので)で進めている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】林産学

【研究領域課題番号】14360094 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

セルロース / 糖質分解酵素 / セルラーゼ / 糸状菌 / プロテオーム / バイオインフォマティクス / Phanerochaete chrysosporium / 遺伝子発現 / 糖質関連酵素 / 糖分解酵素 / クローニング / キシラン / セロビオース脱水素酵素 / 担子菌 / β-グルコシダーゼ / Grifola frondosa

【研究成果の概要】

糸状菌によるセルロース分解は菌体外においてセルラーゼによりセルロースがセロビオースに変換され,さらにβ-グルコシダーゼによってセロビオースはグルコースに変換されたのち,菌体内に取り込まれてエネルギー源として代謝されていくと考えられてきた。しかしながら,多くの糸状菌ではβ-グルコシダーゼに加えて,セロビオース脱水素酵素と呼ばれる酸化還元酵素がセルロース分解過程で生産されてくることが知られている。
そこで,本研究では,糸状菌が生産する主要なセルラーゼCe17によるセルロースから分解生成物として得られるセロビオースの代謝に関連して,菌体外β-グルコシダーゼ(BGL)およびセロビオース脱水素酵素(CDH)の酵素機能とその遺伝子発現解析を行った。その結果,そのいずれにおいても菌体外でのセロビオース代謝にはCDHのみが関与しており,菌体外BGLは関与しないことを明らかにした。また,菌体外BGLの生理的機能が菌体壁グルカンに関与することを示す生化学的データを得た。さらに,木材劣化に関与する白色腐朽菌のみならず,褐色腐朽菌においてもCDHが同様の働きをしていることを示すデータを得た。
また,白色木材腐朽菌Phanerochaete chrysosporiumのゲノム情報を利用することで,セルロース分解培養系におけるプロテオーム解析の結果,11種類の糖質加水分解酵素とCDHを2次元電気泳動上で確認することができた。さらに,ゲノム情報を用いて1種の新規の菌体外チトクロムb562をコードするcDNAをセルロース培養系からクローニング成功し,またこの遺伝子をメタノール資化性酵母菌Pichia pastorisの発現系において活性型タンパク質として生産することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】16,800千円 (直接経費: 16,800千円)

【研究分野】林産学

【研究領域課題番号】09876043 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

セルロース / 酸化 / TEMPO / セルラーゼ / 機能化 / 生物分解性 / 表面改質 / 選択性 / セルロース誘導体 / CMC / 再生セルロース / 生分解性 / キチン

【研究成果の概要】

1. 天然セルロースを一旦溶解して調製した再生セルロース、あるいは17.5%水酸化ナトリウム水溶液で膨潤-洗浄したマーセル化セルロースを出発物質とし、水溶性の安定ラジカルであるTEMPO(2,2,6,6-テトラメチルピペジニル-1-オキシラジカル)を触媒量添加して、臭化ナトリウムと次亜塩素酸で酸化処理を行うことにより、セルロースのC6位の水酸基のほとんどすべてが選択的に酸化されてカルボキシル基に変換した水溶性ポリグルクロン酸(セロウロン酸)を定量的に調製することができた。2. 綿セルロース、針葉樹漂白クラフトパルプを58%ロダン塩(チオシアン化カルシウム)水溶液に加熱溶解し、水中で再生させた再生セルロースゲルを出発物質として用いることにより、高重合度のセロウロン酸を効率的に調製することができた。
3. 得られたセロウロン酸は市販の粗精製セルラーゼを室温で1ヶ月程度処理することにより、セロウロン酸オリゴマーからグルクロン酸にまで加水分解的に低分子化された。これは、セルラーゼ中に不純物として含まれている酵素の作用による。従って、新しい水溶性の多糖類であるセロウロン酸の生分解性を確認した。これは、従来の水溶性セルロース誘導体では期待できなかった特性である。
4. 天然セルロースをTEMPO触媒酸化したところ、水溶性のセロウロン酸は得られなかったが、セルロース表面にカルボキシル基を微量導入することができた。この表面酸化パルプから紙の調製した場合、パルプ表面のマイナスの表面荷電を強めることになり、抄紙におけるサイズ剤、紙力剤などのウェットエンド添加剤成分を効率的に定着する機能が付与された。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】1,700千円 (直接経費: 1,700千円)

【研究分野】林産学

【研究領域課題番号】08306009 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

セルロースミクロフィブリル / セルロースIβ / セルロースIα / 平行鎖構造 / βキチン / セルラーゼ / バロニアセルロース / 非晶領域 / セルロースI_β / セルロースI_α / セルロース / バロニア / シオグサ / 二相性 / 成長応力 / バクテリアセルロース / 結晶弾性率 / セルロースの圧電性 / 圧電

【研究成果の概要】

(1) 構造・形態:セルロースミクロフィブリル中での分子鎖は、パラレルアップであり、セルロース分子の還元末端がc軸方向を向いている。分子鎖形成の重合反応が非還元末端で起こる。また、セルロースIβは捩じれていて、厳密な結晶ではないと考えた方がよい。IaとIβとでは、表面が異なる。IaとIβの違いは、木材セルロースでは一次壁と二次壁とでストレスに差があって、それが原動力となって違いを生じるという。加水分解物による高度配向試料を調製することができた。それを重水素置換して中性子回折を行い、結晶中の水素原子の位置を推定できた。その結果、セルロースIIは逆平行鎖構造であり、その理由が分子の疎水面の形状で説明できる可能性を示した。平行鎖構造のベータキチンは一定濃度以上の塩酸で膨潤すると逆平行鎖構造のαキチンに変態するが、そのメカニズムはセルロースの場合と同じである。
(2) 物性:セルロース結晶の熱膨張を詳細に検討し、幾つかの新知見を得た。分子鎖方向には膨張せず、a軸方向が主である。ミクロフィブリル間で熱分解の抵抗性に著しい差がある。セルロース結晶のポアソン比が測定された。木材の力学物性から、セルロースミクロフィブリルには安定した結晶相、非晶相以外に不安定結晶相を考えると都合がよい。この相は水分で非晶化する。木材のヤング率から、ミクロフィブリルの長さ方向に存在する非晶領域は分子鎖の配列、比容からして結晶のそれと大差はない。2相説に基づく繊維の場合は、ミクロフィブリルの幅、長さ方向に非晶が存在する。
(3) 酵素分解性:酵素 特異性とともに、セルロースの状態すなわち高次構造によって著しい差異がある。高結晶バロニアにも特異的な領域がある。
以上、セルロースミクロフィブリルは、起源によって大きい違いがあることが判明した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】10,600千円 (直接経費: 10,600千円)