【研究領域課題番号】18K19324 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アクチンフィラメント / ミオシン / 収縮環 / リポソーム / アクチン結合タンパク質

【研究成果の概要】

動物細胞における収縮環は、主にアクチンフィラメント、ミオシン、アクチン架橋タンパク質（ACP）から構成される収縮性のリング状構造体である。収縮環様構造体を再構成して機能させるモデル系の創出を目指し、in vitro及びリポソーム内でその形成条件や分子プロセスを検討した。１分子イメージングにより、ミオシンのアクチンフィラメント切断活性や複数のACPの結合特性を明らかにした。In vitroおよびリポソーム内で、細胞骨格からなる構造体は、アクチンフィラメントの切断活性に依存することが分かった。これらの結果は、収縮環様構造体の形成はアクチン調節タンパク質によって制御しうることを示唆している。

【研究の社会的意義】

細胞が二分して増殖することは、生命の基本的現象であり、その解明は生命科学の主要な課題のひとつである。本研究は、細胞分裂研究の新たな手法の創出を目指し、収縮環形成機能を研究するに当たりその学術的意義がある。この新たな手法から得られた知見は、細胞分裂（増殖）がかかわる再生医療の分子基盤に繋がることが期待でき社会的意義が高い。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2018-06-29 - 2020-03-31

【配分額】6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)

【研究分野】構成的システム生物学

【研究領域課題番号】16KT0065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微小管 / アクチンフィラメント / キネシン / ミオシン / FRET張力センサー / FRET力センサー / 光ピンセット法 / 細胞骨格 / ダイニン / ミオシンミニフィラメント / FRET / 力センサー / メカノセンサー

【研究成果の概要】

細胞機能を統合する伝達システムの実態を明らかにするため、細胞骨格を主体とした「力学伝達システム」の可能性に着目した。細胞骨格間の張力を定量できるFRET張力センサーの開発を行い、細胞骨格である微小管やアクチンフィラメント間にはたらく力学特性やその結合タンパク質の力学特性を検討した。細胞骨格からなるネットワークの形態は、細胞骨格タンパク質、細胞骨格を架橋するタンパク質、細胞骨格に作用するモータータンパク質の濃度、及び、ATP濃度に依存した。以上のことより、細胞骨格である微小管やアクチンフィラメントは力学的なネットワークを形成し、そのネットワークが力学的に制御される可能性を示唆する結果を得た。

【研究の社会的意義】

細胞機能を統合する伝達システムとして、従来から多く調査されている化学信号伝達システムを補完する、もしくは統合して新たな伝達システムとなり得る細胞骨格を主体とした「力学伝達システム」の可能性を提示でき、学術的意義がある。これらの知見は、人工細胞の創製や再生医療における分子基盤に繋がることが期待でき、社会的意義も高い。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-07-19 - 2019-03-31

【配分額】16,640千円 (直接経費: 12,800千円、間接経費: 3,840千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】21370061 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アクチンフィラメント / ミオシン / コフィリン / 協同的結合 / 張力 / メカノセンサー / 細胞極性 / アクチン / アクチン結合タンパク質 / 協同的構造変化 / GFP

【研究成果の概要】

われわれは、アクチンフィラメントが様々な異なった原子構造をとることにより異なったアクチン結合タンパク質と相互作用し、異なった機能を果たすことができるという仮説の検証を試みた。その結果、張力によりらせんピッチが伸びたアクチンフィラメントはミオシンIIと相互作用しやすいこと、および、ミオシンIIとコフィリンという異なるアクチン結合タンパク質をアクチンフィラメントと共存させると、結合部位が競合しないにもかかわらず、両者はそれぞれ相互排他的にアクチンフィラメントと結合することを見出した。これらはいずれも上記仮説を支持する結果である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】08458213 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / ミオシン / スペクトリン / 1分子結合力 / 顕微計測 / 生体分子モーター / 顕微操作 / 温度パルス顕微鏡 / pN,nm顕微解析 / アクトミオシン硬直結合 / 双頭結合,単頭結合

【研究成果の概要】

(1)アクチンフィラメントの後端に結合した直径1μmのポリスチレンビーズを、レーザー光ピンセットによって顕微操作し、アクチンフィラメントとアクチン結合性タンパク質との間の分子間結合に負荷を加え、結合の破断力などを繰り返し顕微計測することができる方法を、この数年間で我々は確立した。この方法を、アクチンフィラメントとスペクトリン(赤血球の裏打ちタンパク質の一種)との1分子結合(破断)力の計測に応用した。その結果、予備的実験ではあるが、結合の破断力として、平均3pNという値が得られた。これは、アクチンフィラメントとミオシン間の硬直結合力(平均9pN)や、α-アクチニンとの結合力(平均15pN)と比べて有意に小さい。
(2)アクチンフィラメントとミオシン(HMM)分子間の硬直結合の破断力の測定については、単頭のHMMを調製して双頭のHMMと比較した。その結果、単頭HMMの破断力の分布は約7pNにピークを持つのに対して、双頭HMMでは数pNから20pNにわたる広い分布を示した。(7pNと10数pNとに2つのピークをもつ)。このことから、アクチンとHMM分子との結合力は、単頭と双頭とで約2倍異なることが示唆された。
(3)アクチン分子を、蛋白分解酵素Subtilisinで処理すると、アクチンSubdomain2が2カ所で限定分解される(質量分析とペプチドシークエンサーによって切断箇所を同定した)が、そのことによって、HMM分子による滑り速度と滑り力が約20%に減少した。ところが、硬直結合の破断力は70%程度にしか低下しなかった。このことから、アクチンのsubdomain2は、ATP存在下での滑り機能に重要な役割を演じているが、ATP非存在下での硬直結合にはそれほど関与していないことが推論された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,200千円 (直接経費: 7,200千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】04402053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋収縮 / メカノケミカルカップリング / 筋原線維 / In vitro滑り運動系 / 顕微画像解析 / レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / 分子モーター / in vitro 滑り運動系 / in vitro滑り運動系 / アクチン / ミオシン

【研究成果の概要】

1.単一筋原線維の構造・力学特性と化学反応とを光学顕微鏡下で位相差像あるいは蛍光像として同時画像化し、解析することのできる顕微操作・顕微解析装置を製作した。この装置は、2波長蛍光励起装置、倒立顕微鏡、顕微鏡操作装置、蛍光用特殊フィルター・ミラー、double-View (W)光学系、超高感度テレビカメラ、ビデオ、画像処理コンピュータからなる。
2.アクチンフィラメントに特異的に結合し、しかもpH感受性を持つ蛍光物質SNAFL-Phalloidin (SF-Ph)を合成し、これを用いて筋原線維を染色し、ATPase活性に伴うpHの減少を画像として捉えた。しかしSF-Phは2波長励起・1波長検出に適しており、W光学系を活用できないので時間分解能は高々1s程度であった。そこで、1波長励起・2波長検出に適し真の意味で同時画像化が可能なW光学系を活用できるSNARF-Ph (SR-Ph)を特注したので、現在研究を進めている。
3.直径1μm程度のプラスチックビーズを70pNの力で捕捉し、顕微操作することのできるレーザー光ピンセット装置(赤外YLFレーザー(1W)、赤外光導入用に特注改造した倒立顕微鏡からなる)を組み上げた。
4.in vitro滑り運動系において、低濃度のATP存在下でアクチンフィラメントに発生する滑り力と1個のATP分子の分解に伴うステップサイズとを光ピンセットを用いて顕微計測した。滑り力は最大捕捉力の下で約3pNであり、ステップサイズは約10nmであった。一方、ATP非存在(硬直条件)下でのアクチンフィラメントと一個のミオシン(HMM)分子との間の硬直結合の破断力を計測し、平均9.2pNという値をえた。同時に得られた張力-歪み曲線の最大傾斜から求めたHMM分子の弾性率は、約0.5pN/nmであった。

【研究種目】一般研究(A)

【研究期間】1992 - 1994

【配分額】44,000千円 (直接経費: 44,000千円)