【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】07680728 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋収縮系 / 心筋収縮系 / アクチンフィラメント / ゲルゾリン / 高次構造の再構成 / 筋原線維

【研究成果の概要】

これまで骨格筋・心筋収縮系において、アクチンフィラメント(FA)切断蛋白質ゲルゾリンを用いて選択的に細い(アクチン)フィラメントを切断除去し、収縮機能を失ったFA除去筋モデルを出発点にして、これに適当な環境下で精製アクチンを加えて細いフィラメントの構造と機能とを再構築することを試みてきた。この試みは、特に心筋収縮系で成功し、最終的に、張力が平均で元のものの1.3倍にも達するという結果を得た。しかも、電子顕微鏡観察によって確かに細いフィラメントが再構築されており、その平均の長さがもとのものよりも長くなっていることが確認された。平均1.3倍の張力増強は、この再構成アクチンフィラメントの長さによってほぼ説明されるが、ある場合には2倍以上の張力増強が見られるので、未知の張力抑制因子を再構成しきれていない可能性も残されている。そこで心筋線維に存在する微量蛋白質についてこのような機能がないか検索した。今のところこれを支持する結果は得られていないが、今後さらに検討したい。ところで、これらの心筋収縮系の研究は、直径数十μmの心筋筋線維の束を用いて行われてきたが、光学顕微鏡下での構造解析研究を可能にするためには、直径数μmの心筋筋原線維を用いる必要がある。そこで試料調製法を工夫した結果、顕微操作・解析可能な心筋筋原線維が得られるようになった。これを用いて、心筋収縮系におけるコネクチンの弾性に関する研究(ゲルゾリン処理筋を含めて)を顕微鏡下で行った。
再構成実験に適した筋収縮系としては、遅筋(赤筋)や飛翔筋が考えられるが、予備的実験では有望であり、研究目的によって使い分けるのも面白いと思われる。本研究を通じて、このFA除去筋収縮系とその再構成系が、細いフィラメントの構造と機能を研究する上で今後ともユニークな実験系として重用されるであろうことが確認された。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1995

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】04402053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋収縮 / メカノケミカルカップリング / 筋原線維 / In vitro滑り運動系 / 顕微画像解析 / レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / 分子モーター / in vitro 滑り運動系 / in vitro滑り運動系 / アクチン / ミオシン

【研究成果の概要】

1.単一筋原線維の構造・力学特性と化学反応とを光学顕微鏡下で位相差像あるいは蛍光像として同時画像化し、解析することのできる顕微操作・顕微解析装置を製作した。この装置は、2波長蛍光励起装置、倒立顕微鏡、顕微鏡操作装置、蛍光用特殊フィルター・ミラー、double-View (W)光学系、超高感度テレビカメラ、ビデオ、画像処理コンピュータからなる。
2.アクチンフィラメントに特異的に結合し、しかもpH感受性を持つ蛍光物質SNAFL-Phalloidin (SF-Ph)を合成し、これを用いて筋原線維を染色し、ATPase活性に伴うpHの減少を画像として捉えた。しかしSF-Phは2波長励起・1波長検出に適しており、W光学系を活用できないので時間分解能は高々1s程度であった。そこで、1波長励起・2波長検出に適し真の意味で同時画像化が可能なW光学系を活用できるSNARF-Ph (SR-Ph)を特注したので、現在研究を進めている。
3.直径1μm程度のプラスチックビーズを70pNの力で捕捉し、顕微操作することのできるレーザー光ピンセット装置(赤外YLFレーザー(1W)、赤外光導入用に特注改造した倒立顕微鏡からなる)を組み上げた。
4.in vitro滑り運動系において、低濃度のATP存在下でアクチンフィラメントに発生する滑り力と1個のATP分子の分解に伴うステップサイズとを光ピンセットを用いて顕微計測した。滑り力は最大捕捉力の下で約3pNであり、ステップサイズは約10nmであった。一方、ATP非存在(硬直条件)下でのアクチンフィラメントと一個のミオシン(HMM)分子との間の硬直結合の破断力を計測し、平均9.2pNという値をえた。同時に得られた張力-歪み曲線の最大傾斜から求めたHMM分子の弾性率は、約0.5pN/nmであった。

【研究種目】一般研究(A)

【研究期間】1992 - 1994

【配分額】44,000千円 (直接経費: 44,000千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】02680213 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体運動モデル / 筋原線維 / 滑り運動 / アクチンフィラメント / ミオシンフィラメント / ゲルゾリン / 筋フィラメントの多重ねじれ

【研究成果の概要】

生体運動の分子メカニズムの研究が、新しい局面を迎えている。そこで大きな役割を演じているのは、ミオシン分子を吸着させたガラス表面上でアクチンフィラメントの滑り運動を起こさせるという、in vitro運動系である。ところがこの系は、ミオシン分子がランダムに分散したもので、筋線維のような配向系のモデルとしては不十分である。そこで我々は、分子配向したin vitro運動系の開発を試みた。まず第一に、(1)アクチン切断タンパク質ゲルゾリンによって筋原線維からアクチンフィラメントを選択的に除去し、残ったA帯を、ミオシンフィラメントが配向したモデル配向系として用いた。その結果、蛍光標識したアクチンファラメントは、A帯(ミオシンフィラメント)表面の一端から他端へとほぼ等速度で運動することが分かった。ミオシン分子の配列はA帯中央部を境にして逆向きだが、アクチンフィラメントの運動性は、このミオシン分子の配列の違いによって影響を受けないことになる。用いた筋原線維は、A帯の短いウサギの腸腰筋とA帯の長いアメリカザリガニ爪の筋肉であり、ともに骨格筋である。今後は、一本のアクチンフィラメントがA帯内部を滑り運動できるようにし、より一層生体系に近いモデル系にしたい。つぎに、(2)滑り運動するアクチンフィラメントが回転運動するか否かを検証する目的で、通常のガラス表面上でのin vitro運動系を工夫した。すなわち、アクチンフィラメント先端部がガラス表面に付着するようにし、さらに後端部がHMM(ミオシン分子の活性断片)トラック(Toyo shimaらの開発)の上を滑り運動するようにした。すると、フィラメントの中間部が弛んだ後、左巻ラセンを経て、DNAで見られるような多重ねじれが形成された。この事実はin vitro運動に際して右巻トルクがフィラメントに作用することを示している。これによって、力発生機構を理解する上での一つの手がかりが得られた。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1990

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】63460236 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋原線維 / 顕微操作 / 自発的振動収縮 / 筋フィラメント / 筋収縮 / ゲルゾリン / アクチン / βーアクチニン / 収縮系の再構築 / ミオシンフィラメント / アクチンフィラメント / 微量調節タンパク質

【研究成果の概要】

今年度の成果の第一は、直径1ー2μmの単一筋原線維や直径数μmの筋原線維束を顕微操作できるようになったことである。総合倍率400ー600倍の倒立位相差顕微鏡下で、液交換できるようにした自作の薄いセルの中で、2本のガラス針に筋原線維の両端を引っかける。ガラス針の一方を細くして、その曲がりの程度から発生張力を見積る。その結果、SPOCとよぶ自発的振動収縮の条件下で、筋原線維が弱いながらも張力を発生し、振動することが分かった。さらに、このようなことが可能になったために、筋フィラメントを精度よく解体できるようになり、しかも再構築が容急になり、同時にその収縮特性をも検討できるようになった。予備実験として、太いフィラメントを両端溶解した後のSPOC(フィラメント長が半分になっても振動する)や、ゲルゾリン処理法によって細いフィラメントを選択除去し、その後精製アクチンを加えて細いフィラメントを再構成した筋原線維の発生張力などを検討した。
ところで、本研究のテ-マの一つである、細いフィラメントの自由(P)端に結合しているはずのβーアクチニンについては、その発見者の丸山工作氏(千葉大、理)自身によって、P端ではなくB端キャップである可能性が強く示唆されたことによって、現在ほとんど白紙に近い状態になってしまった。つまりこれまでβーアクタニンといわれてきた35kDと31kDの2量体は、B端キャップであるということである。しかし我々は既に、独自の方法で、少なくとP端キャップが存在することを示している。また我々は、ゲルゾリン処理法によって細いフィラメントの自由端を単離し、この分画に35kDと31kDの成分がほぼ等量存在することを確認した。(船津等)が、P端キャップの同定のためには、今まで以上により詳細な検討が必要であることが判明した。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1988 - 1989

【配分額】7,300千円 (直接経費: 7,300千円)