【研究分野】植物栄養学・土壌学

【研究領域課題番号】10356003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

鉄欠乏 / fre1 / nas / naat / クロロシス / アルカリ土壌 / ムギネ酸 / トランスジェニック・タバコ / 鉄欠乏耐性 / 形質転換植物 / イネ / タバコ

【研究成果の概要】

1.ニコチアナミンアミノ基転移酵素遺伝子(naat)を導入した鉄欠乏耐性イネのT2世代を作出した.
2.酵母の3価鉄還元酵素遺伝子(Fre1)をタバコ用に改変したrefre1遺伝子をPCR法により全合成し,これを遺伝子導入したタバコを作出した。このタバコを石灰質アルカリ土壌で検定したところ,野生株のタバコのアルカリ土壌耐性を凌駕する株がえられた.
つぎに,このrefre1の至適PHがアルカリ側でも高い酵素活性を有しているアルカリ土壌耐性タバコの作出を狙って,Mnイオン濃度を変えた変異導入法によりin vitro evolution(試験管内進化)を行い遺伝子改変を行なった.このrefre1:1遺伝子をタバコに導入し,アルカリ土壌で検定し,耐性株を作出することに成功した.
3.FeCl2,Fe3+-EDTAを内包した被覆鉄系資材を合成して,アルカリ土壌で,種々の野菜,インゲン,水稲,陸稲に対する施肥法を検討した.試験の結果,施肥法の難しさが浮き彫りにされた.作物はその根と被覆肥料が緊密に接触しない限り,被覆肥料から溶けてきた鉄がすぐに不溶態化してしまうので鉄イオンを吸収できないことが明確になった.被覆肥料の中に「ムギネ酸鉄」を内包させた肥料を将来作出したい.

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】22,200千円 (直接経費: 22,200千円)

【研究分野】植物栄養学・土壌学

【研究領域課題番号】09460037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

鉄欠乏 / イネ科植物 / オオムギ / ムギネ酸類 / 免疫組織化学 / ムギネ酸顆粒 / ニコチアナミン合成酵素 / ニコチアナミンアミノ基転移酵素 / 鉄欠乏耐性 / 植物の鉄栄養 / 細胞化学 / ムギネ酸 / イネ / 形質転換植物 / Ids3

【研究成果の概要】

イネ科植物の鉄獲得機構の主要な構成要因はムギネ酸類の合成と分泌である.ムギネ酸類生合成経路上の酵素のうち,S-アデノシルメチオニン3分子からニコチアナミンを生成するニコチアナミン合成酵素(NAS)と,ニコチアナミンからケト中間体を生成するニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)は,鉄欠乏によって強く誘導される.この両酵素タンパク質を鉄欠乏オオムギ根より精製し,これらをコードする遺伝子を単離した.NASは7個,NAATは2個のクローンが得られた.NAS,NAAT遺伝子を大腸菌で大量に発現させ,得られたタンパク質から両酵素のポリクローナル抗体を作成した.この抗体を用いて,光学顕微鏡レベルと電子顕微鏡レベルで,両酵素の鉄欠乏オオムギ根における組織内局在と細胞内局在を調べた.その結果,NASとNAATの両酵素は鉄欠乏オオムギ根に特異的に現れる顆粒に存在することが明らかになった.さらに,35Sプロモーターの下流にこの遺伝子とクラゲ緑色タンパク質をつないで,コムギの培養細胞に発現させるとこのタンパク質は顆粒状の構造に局在することが示された.この顆粒の限界膜にはリボゾームが付いており,粗面小胞体由来と考えられる.NAATがこの顆粒に局在することは,NAATタンパク質のN末端側に小胞体移行のためのシグナルペプチドが存在する結果とも一致した.ムギネ酸の分泌は日周性を示すが,ムギネ酸が分泌される日の出前にはこの顆粒は大きく膨らんでおり,分泌後には小さくなることから,ムギネ酸類が分泌されるまでの間ここに貯蔵されると想定されていた.ムギネ酸類合成系の主要な2つの酵素が共にこの顆粒に存在することが明らかになったことにより,この顆粒がムギネ酸類合成の場であることが証明された.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】11,500千円 (直接経費: 11,500千円)

【研究分野】植物生理

【研究領域課題番号】08740619 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イネ / 短日植物 / 日長感受性 / トランスポゾンタギング / Ac / Ds / 形質転換植物 / 分子生物学

【研究成果の概要】

イネは代表的な短日植物であり、開花時期に影響を与えるさまざまな遺伝子座が同定されているが、いまだ遺伝子単離には到っていない。そこで、我々は、非自律性転移因子Dsと転移酵素をコードする35S-AcTPase導入形質転換イネを交配して得られた個体(F1)の自殖後代(F2)を用い、開花時期が早くなる個体を選抜し、その後代を用いた解析を行っている。
開花が早い突然変異系統B-10-1-80は安定な表現型を示し、Dsを1コピーゲノム内に持っている(Ds80)。この系統を短日・長日条件下で栽培すると、短日条件下では開花に差は見られないが、長日条件下で約10日開花が早くなる。このことから、この系統の変異した遺伝子は、本来、その機能が短日条件において抑制されるため、短日条件下での開花に変化がないと考えられる。F2解析の結果、B-10-1系統は2つの遺伝子変異を持つと推定された。そのうち、ひとつは優性変異、もう一方は、劣性変異と考えられる。Ds80と表現型の連鎖を調べたところ、開花時期が野生型と同じF2個体にDs80をヘテロの持つ個体が複数存在するので、優性変異がDs80のタッグによる可能性は低いことが明らかになった。現在、もう一方の劣性変異とDs80の連鎖についてF3世代を用いて解析中である。
突然変異系統C-2-3-241系統のF5世代を用い、開花時期を調べたところ、短日条件下で平均6日、長日条件下で平均12日早く開花するとの結果を得た。このことから、C-2-3系統の変異した遺伝子は本来、恒性的に開花を抑制する機能を持つ遺伝子と推定される。C-2-3-241はDsを1コピーのみゲノム内に持ち(Ds241)、現在、表現型とDs241の連鎖について解析を行っている。
RI系統及びYACクローンによるマッピングの結果、Ds80は染色体6番、Ds241は染色体11番にそれぞれ座乗することが明らかになった。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1996

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)

【研究分野】植物生理

【研究領域課題番号】07740620 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イネ / 日長感受性 / トランスポゾン・タッギング / Ac / Ds / 分子生物学 / 形質転換植物 / Se-1

【研究成果の概要】

イネは代表的な短日植物であり、日長感受性をはじめ、開花に影響を与えるさまざまな遺伝子座(Se-1,E1,Ef-1等)が多数同定されているが、いまだ遺伝子単離には到っていない。そこで、我々は、トランスポゾンタギング法によるイネ開花時期決定遺伝子の単離を目標に研究を行っている。現在までに、Dsと35S-AcTPase(CaMV35SプロモーターにAcTPaseのcDNAを結合した遺伝子)導入形質転換イネを交配して得られた個体(F1)の自殖後代(F2)を用い、開花時期が早くなる個体を選抜し、その後代を用いた解析を行っている。選抜した突然変異系統のF5世代を用い、短日条件下(10L 14D)ならびに長日条件下(14L 10D)における開花時期を調べたところ、C-2-3-241系統では、短日条件下で平均6日、長日条件下で12日早く開花するとの結果を得た。このことから、C-2-3系統の変異した遺伝子は本来、恒性的に開花を抑制する機能を持つ遺伝子と推定される。サザン解析によるC-2-3-241はDsを1コピーのみゲノム内に持つ(Ds241)ことから、このDsの挿入により突然変異が誘発された可能性がある。そこで、IPCR法によりDs241近傍のゲノムDNA断片を単離し、そのDNA配列を決定した。この配列をもとにプライマーを作製し、C-2-3由来の241を含むF4世代5個体に関して、PCR法によるDsの有無を確認することで、表現型とDsの連鎖を確認できた。次に、イントロン・エクソン領域を予測し、その結果をもとにプライマーを作製、RT-PCRを行ったところ、少なくとも、Ds241近傍に転写されている領域が存在することを確認した。現在、Ds241の挿入が開花時期に影響を与える突然変異の原因であるかどうか知るために、F2解析ならびに復帰突然変異体の同定を試みている。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1995

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)