Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

ダイズ / アスパラギン酸プロテアーゼ / コムギ / システインプロテイナーゼ / シスタチン / 維管束

ダイズには5種類のAP(soyAP1〜soyAP5)が存在する。このうち、soyAP1とsoyAP1は57%の相関性を示す。ノーザン解析からsoyAP1は乾燥種子に特異的に発現するのに対し、soyAP2は乾燥種子以外の根、茎、葉、花などに発現する。soyAP1は乾燥種子以外でも発芽の早い時期には発現しているが、発芽が進むにつれて、発現は停止した。一方、soyAP2は室温で48時間吸水させるとその発現は上昇した。このように、両者の発現パターンは大きく異なっていた。soyAP1のように乾燥種子特異的APは今までに報告がないことから、私達はsoyAP1のダイズ種子における機能について解析を行った。まず、発現の部位を知るためにin situハイブリダイゼーションを行った。その結果、soyAP1は未成熟の篩管および導管に強く発現していることが明らかになった。ところがその発現は成熟に伴って著しく低下した。以上のことからsoyAP1は、未成熟の篩管において成熟化する過程、おそらくプログナム細胞死のような過程で作用している可能性が示唆されてた。
コムギ種子から4種のシスタチン(WC1〜4)をクローン化した。すべて登熟期の初期に発現が高く、その後減少した。さらに、発芽1日の種子においても発現が認められた。WC1はいつの時期でもWC2やWC4にくらべ高発現していた。WC1とWC4はアリューロン層ならびに胚に局在していたが、WC1は胚乳にも局在していた。このようにmRNAの発現量や、局在部位の違いから、これらのWCの種子生理学的な役割は異なっていることが示された。

シスタチン / フィトシスタチン / システインプロテイナーゼ / トランスジェニック植物

研究代表者らは、生体防御因子としてのフィトシスタチンの機能の解明、およびその有用性の検索を行った。以下に、これら2点について個別に本年度の研究実績を示す。
1.昆虫の生育抑止効果の分子レベルでの解明
オオムギのシステイン型プロテイナーゼ(CP)であるアリューレインをプローブに用い、モデル昆虫であるショウジョウバエの遺伝子ライブラリーをスクリーニングした結果、数種の陽性クローンをを得た。このうちの1つの塩基配列を解析したところ、CPをコードするしていることが判明した。この遺伝子DCP1の発現部位を解析するため、DCP1に対するcRNAを合成し、ショウジョウバエの胚およひ幼虫を用いて、in situハイブリダイゼーションを行ったところ、DCP1が消化管において大量に発現していることが明らかとなった。これにより、植物シスタチンの抗虫効果は昆虫消化管CPの阻害による昆虫生育抑止効果である可能性が強く示唆された。続いて、コクゾウの遺伝子ライブラリーを作製し、このDCP1をプローブに用いてスクリーニングを行ったところ、陽性クローンが得られた。現在、その塩基配列を解析している。
2.耐虫性イネの分子育種
イネのカルスより調製したプロトプラストに、トウモロコシのシスタチン(CC)遺伝子を薬剤耐性遺伝子とともにエレクトロポーレーション法により導入し、薬剤耐性選抜をかねてカルスへと再生させた。再生カルスから、ゲノムサザン分析により、CC遺伝子が導入されたものをさらに選抜し、ついでノーザン分析により、CCmRNAの発現を調べた。現在、発現が認められたカルスについて、植物体への育種を試みている。

シスタチン / システインプロテイナーゼ / プロテアーゼインヒビター / 殺虫効果 / クローニング / cystatin(シスタチン) / cystein proteinase(システインプロテイナーゼ) / proteinase inhibitor(プロテアーゼインヒビタ) / cystatin / cysteine proteinase / proteinase inhibitor / cloning

本研究は種実シスタチンの構造とシステインプロティナーゼ阻害活性の相関を解析するとともに、種実におけるシスタチンの存在理由の1つと予想される殺虫機能(コクゾウムシ)などの昆虫における食害を抑止する機能を検証し、新しい見地からの食糧種実の育種に基礎的寄与することを目的に実施された。
食糧種実としてはトウモロコシ、コムギ、ダイズを選んだ。これらの植物よりシスタチンのクローニングを行ったところ、コメ種子中より見い出されたオリザシスタチンと相同性の高いシスタチンの存在が明かとなった。種実シスタチンの一次構造および遺伝子構造はいずれも類似しており、シスタチンの活性中心の1つとされている、Q×V×Gの配列を有していた。それぞれの相同性は約60〜70%と高く、また遺伝子構造において動物起源のシスタチンとは大きく異っていた。このことより植物シスタチンは動物シスタチンとは異なるphytocystatinファミリーを形成しているものと推定された。
これらのクローニングされた遺伝子を大腸菌に導入しシスタチン蛋白質を大量生産し、酵素学的性質を調べたところ、いずれにおいても強いパパイン阻害活性を有していることが判明した。
昆虫の消化管(コクゾウ虫およびアズキゾウ虫)由来のシステインプロテイナーゼに対しても強い阻害活性を示した。このことからシスタチン蛋白質の殺虫効果を推定する有力な傍証が得られた。

【研究分担者】
松本一朗	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
榎森康文	東京大学	理学部	助教授	(Kakenデータベース)
阿部啓子	東京大学	農学部	助教授	(Kakenデータベース)