【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バクテリオファージ / 分子機械 / 分子認識 / 分子集合 / 感染 / 超遠心分析 / X線結晶構造解析 / 微生物 / 超分子構造 / リゾチーム / テイルリゾチーム / 収縮姓尾部 / 感染機構 / バクテイオファージ / T4ファージ / プロセッシング / 蛋白質工学 / T4類縁ファージ / βヘリックス

【研究成果の概要】

本研究は、バクテリオファージの収縮性尾部を対象として、ナノマシーンとしての尾部の分子集合機構および作動原理を分子・原子レベルで明らかにしようとするものである。3年間の成果のうち、特に重要なものは以下の通りである。
パーデュー大学ロスマン教授のグループとの共同研究により、尾部収縮後の構造が電顕画像からの3次元像再構成によって明らかになった。収縮後の低分解能の電子密度にもこれまでに決定された7つの蛋白質の高分解能構造が無理なくあてはまったことにより、構造変化では個々のサブユニットの構造は大きく変化せず、主に配置変換によってマクロな構造変化が起こっていることが明らかである。さらに、この構造変化の主役を担っているのがgp10で、この蛋白質が長軸に関して回転することにより、それまでgp12(小尾繊維)に結合していたgp11が尾繊維(gp34)に結合することが分かった。
テイルリゾチームgp5はプロセッシングを受けて351残基目のセリンのC端で切断されるがこれをロイシンに置換したgp5は切断が起きないことが分かったので、この変異体を調整して構造決定を行うことが出来た。その結果、これまで明らかでなかった切断部位周辺の15残基の構造が明らかになり、また、隣のサブユニットから出ているペプチドが基質認識部位を占拠することによってリゾチーム活性を抑制している現象は切断の結果ではなく、切断以前に起こっていることが分かった。
T4類縁ファージKVP40のテイルリゾチームgp5の単離・性状解析およびgp27対応蛋白質の発見:テイルリゾチームgp5はリゾチームドメイン・C末端β-helixを含む特異な構造を有し、N末端ドメインでgp27と結合し、gp27を介して基盤と結合している。T4近縁のファージではgp5のドメイン構造は良く保存されているが、遠縁になるに従って類似性が低くなる。KVP40のgp5ではリゾチームが欠損している。このgp5をクローニング、発現、単離して、性状解析を行ったほか、通常のbalst検索では検出されないが、ORF334を候補と考えてクローニング・単離・精製を行ったところ、この蛋白質がgp5と強く結合することが確認された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】15780067 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アラビノフラノシダーゼ / キトビオースホスホリラーゼ / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / タンパク質工学 / 糖質分解酵素 / セロビオースホスホリラーゼ / 加リン酸分解酵素

【研究成果の概要】

最終的に3種の新規な立体構造を決定することに成功し、それらの結晶化および結晶構造に関する国際誌への投稿論文を4報発表した(J.Biol.Chem.,Strcture, Acta Cryst)。また、研究成果を日本農芸化学会大会、応用糖質科学会などの国内学会で発表した。さらに、国際学会でも発表予定である。
GH-54α-L-アラビノフラノシダーゼは、分解能約1.8ÅでMIR法により構造決定した。本構造は同ファミリーでは世界初の立体構造であり、触媒ドメインと糖質結合ドメインに分かれることが分かった。触媒ドメインは、既知の酵素とは大きく異なるフォールドを取っていたが、反応産物との複合体構造と変異体解析により、活性中心を特定できた。一方、糖質結合ドメインは基質の側鎖のみを認識することが明らかになり、このドメインの新規な構造・機能および存在普遍性から、新たな糖質結合ドメイン(CBM42)と認定された。現在、CBM-42の機能解析に関する投稿論文を準備中である。
GT-36キトビオースホスホリラーゼの結晶構造は、1.6Å分解能でMAD法により決定した。本構造も、同ファミリーでは世界初の立体構造であった。また、基質との複合体構造から、反転型加リン酸分解酵素の反応機構が解明された。本酵素の立体構造と反応機構は、数種の糖加水分解酵素と有意な相同性を示すことが明らかになったために、GT-36は糖転移酵素群から糖加水分解酵素群の新たなファミリーであるGH-94に再分類されることが決定した。さらに、同ファミリーに属するもう一つの酵素(セロビオースホスホリラーゼ)も、分解能2.1ÅでMR法により立体構造を決定し、活性中心の詳細を明らかにした。現在、これらの酵素の基質特異性の変換を目指した変異体を作成中である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,900千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】13760058 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

β-ガラクトシダーゼ / 好熱菌 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / タンパク質工学 / 糖質分解酵素 / ラクトース / ガラクトース

【研究成果の概要】

前年度には、新規好熱菌由来β-ガラクトシダーゼ(A4-βGal)の結晶構造を解明することに成功し、nativeおよびガラクトース複合体構造において1.6Åおよび2.2Å分解能の構造がそれぞれ得られた。本構造は、糖質加水分解酵素ファミリー42としては世界初の立体構造であった。本年度は、この構造のさらに詳細な解析と、その結果の国際誌への論文発表を行い、さらに、活性が大幅に上昇した変異体の機能解析・立体構造解析を行った。A4-βGalは植木鉢状の3量体構造をとっており、全体の約20%を占める接触面において強い相互作用で結びついていた。本酵素が産業上有用な酵素である所以であるところの高い耐熱性は、この強力な相互作用によるものであることが推測された。また、活性部位の形成に、隣のサブユニットの残基が関与しており、活性の発現にも3量体化が必要であることが分かった。このように多量体化により活性部位を形成している例は糖質加水分解酵素の中では初めての例であった。なお、ガラクトースの認識機構は、構造既知の大腸菌βガラクトシダーゼとは全く異なっており、新規の基質認識機構が発見された。さらに、A4-βGalの反応機構はアノマー保持機構に従うことを、ファミリー42酵素では初めて、実験的に証明した。しかし、驚くべきことに、本酵素の全体的な立体構造は、本酵素と全く異なる反応機構(アノマー反転機構)に従うβアミラーゼとよく似ていた。従って、本酵素は糖質分解酵素で普遍的に見られる(α/β)8バレルの進化の上で特異な存在であることが明らかになった。
これまで、共同研究者の大津らにより、本酵素の活性が大幅に上昇する変異体(P317S, H323Yおよびそれらの2重変異体)が得られていたが、我々はこれらの機能解析により、P317Sでk_<cat>の上昇、H323YでK_mの減少が起こり、2重変異体ではk_<cat>/K_mで約5.5倍の活性上昇が引き起こされることを見いだした。現在、2重変異体で1.8Å分解能の立体構造を得ており、変異の導入に伴う構造変化が活性中心残基へ伝わることにより、活性の上昇が引き起こされることを見いだしている。本研究の成果の一部は、「応用糖質科学誌」、Journal of Molecular Biology、「構造生物」に掲載された。現在、活性の上昇した変異体の機能・構造解析に関する論文の投稿を準備中である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】11760054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

キシラナーゼ / 白麹菌 / X線結晶構造解析 / タンパク質工学 / 好酸性 / 耐酸性

【研究成果の概要】

キシラナーゼCの至適pHが大幅に上昇した変異体であるD37NのX線結晶構造解析を行った。その結果、Asn37の側鎖は野生型のAsp側鎖に比べて電子密度が不明瞭になっており、酸・塩基触媒であるGlu170との水素結合が弱くなっていることが示唆された。これは、これまで筆者らが示したキシラナーゼCの好酸性機構を支持するものである。
キシラナーゼCの基質結合クレフトの入り口に存在するGlu118の変異体と、D37Nを組み合わせた各種変異体の活性のpH依存性を測定した結果、E118QとE118Aで酸性域の活性が60〜70%程度に低下し、全ての変異体で中性域の活性が120〜230%程度に上昇した。従って、Glu118はキシラナーゼCの好酸性に寄与していることが分かった。
キシラナーゼCの基質結合クレフトに存在するTyr10、Phe131、Trp172の各種変異体酵素の活性のpH依存性を測定した結果、Y10F,F131W以外の変異体では、全てのpH域に渡って活性が90〜40%程度に低下したことから、これらの変異は酵素活性そのものに悪影響を与えていると考えられた。しかし、Y10Fでは酸性域のみで活性が90〜30%程度に低下しており、わずかヒドロキシル基一つの違いが本酵素の好酸性に寄与していることが分かった。F131Wでは、興味深いことに、酸性域にある最大活性が1.5倍に上昇していた。131位の側鎖はサイズの大きいTrpの方が周囲の疎水的な環境を維持するために適していると考えられる。
キシラナーゼBのAsn43は、キシラナーゼCのAsp37に相当する。これをAspに置換した変異体の活性のpH依存性を測定した結果、中性域のみで活性が80〜30%程度に低下しており、中性キシラナーゼでも酸性キシラナーゼと同様にこの残基が活性のpH依存性を決定していることが明らかになった。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】09780592 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗原抗体反応 / 相互作用 / X線結晶構造解析 / 可変領域断片 / 特異性 / 親和性 / 進化工学 / 熱量測定 / ファージ提示系 / 蛋白質工学

【研究成果の概要】

抗体分子の抗原に対する認識能の特徴は高い特異性と親和性にあり、その機構解明は蛋白質の分子設計を行う上で、多くの有益な知見を与える。研究代表者らは、抗原抗体双方に変異を導入し相互作用を解析できる系を構築した。この系を基に、遺伝子工学による部位特異的アミノ酸置換並びに滴定型熱量測定により抗原抗体反応の詳細な解析を行ってきた。本研究では、抗体分子の自在な設計を目指し、以下の二つの観点から研究を推進した。
(1) HyHEL10が弱い認識能を示すシチメンチョウリゾチームに対して、前年度において進化分子工学的手法により選択された変異体の認識能を詳細に解析した。可変領域断片(Fv)並びにペプチドリンカーを用いて一本鎖化した一本鎖抗体(scFv)を大腸菌の分泌発現系を用いて調製し、表面プラスモン共鳴並びに熱力学的に解析した。親和性の向上と特異性の向上は、解離速度定数の大幅な減少に由来していたが、熱力学的には二つの方向性(エンタルピー駆動型、エントロピー駆動型)に分かれていた。一本鎖抗体については野生型が単量体で構成されるのに対し、変異体が二量体と単量体の混合物であることが分かり、このことは可変領域間の相互作用に変化を及ぼしていることを示し、この相互作用の変化が特異性親和性の改良をもたらしていることが示唆された。(2)部位特異的変異導入を施した抗体Fv断片と抗原の複合体について、結晶構造解析を行った。野生型Fvについては、Fabと異なる分子機構で、抗原を認識している可能性が示唆された。塩橋に関与するアミノ酸残基に変異を導入した抗体(32A,96A)と抗原の複合体については、変異導入の効果が、構造変化による場合(32A)と水分子の導入による場合(96A)が観察された。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】06760072 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

β-ラクタマーゼ / アシル酵素 / 触媒機構 / 蛋白質工学 / X線結晶構造解析 / ペニシリン / ドラッグ・デザイン

【研究成果の概要】

申請者は,RTEM-1β-ラクタマーゼE166N変異体が基質であるペニシリンと安定なアシル中間体を形成することを見いだし、その立体構造をx線結晶構造解析により決定した(Nature359,700-705(1992))。その構造から重要と考えられたSer130の触媒における機能を明らかにするため、Ser130置換体を作成し解析した。Ser130側鎖の-OHはアシル中間体ではβ-ラクタム環のN原子と近接していたので、アシル化の開環反応でこのNへのproton donorと考えられた。置換によりこの機能のみが失われると酵素と基質が共有結合した正四面体中間体の蓄積が起こるはずである。まず、S130A変異体を作成して速度論解析したところ予想に反してkcatが1/25程にしか低下せず、むしろKmが約50倍に増加した。コンピュータ・グラフィクスで再検討したところ、SerをAlaに置換したことでできる隙間に水分子が侵入して触媒反応が進行する可能性が示唆された。またKmの低下は、Ser130側鎖の-OHが作る水素結合の構造安定性に対する寄与から理解できた。水分子の侵入をblockできるアミノ酸をグラフィクスで調べたところThrとAsnが候補として考えられたので、S130T、S130N変異体を作成解析した。S130Tでは、水素結合による構造安定性を保ちながら反応性が減少するはずだが、実際Kmの変化なしにkcatが約1/100に減少し予想したモデルが裏付けられた。残存活性は2級アルコールの反応性によると考えられる。この変異株では完全に反応が停止しないので、現在低温条件下、NMRを用いて正四面体中間体の検出条件を検討中である。S130Nでは活性が全く検出できなかったが、共有結合中間体の生成を調べるためペニシリン結合アッセイを行ったところ、ゆっくりとした結合が検出された。現在、結合がアシル化部位で起こっているか、および結晶化を検討中である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1994

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】05760059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

beta-ラクタマーゼ / アシル酵素 / 触媒機構 / 蛋白質工学 / x線結晶構造解析 / ペニシリン / ドラッグ・デザイン

【研究成果の概要】

申請者は,RTEM-1beta-ラクタマーゼE166N変異体が基質であるペニシリンと安定なアシル中間体を形成することを見いだし,その立体構造をx線結晶構造解析により決定した(Nature359,700-705(1992))。本研究では得られた構造から重要と考えられたSer130の触媒における機能を明らかにするため,S130A置換体を作成し解析した。Ser130側鎖の-OHはアシル中間体ではbeta-ラクタム環のN原子と近接していたので,アシル化の開環反応でこのNへのproton donorと考えられた。置換によりこの機能のみが失われると酵素と基質が共有結合した正四面体中間体の蓄積が起こるはずである。S130A酵素を生産する大腸菌のペニシリン耐性度は非生産菌より若干高い程度にまで激減した。ところが変異体を大量精製して基質に対する飽和曲線を求めたところ,予想に反してkcatは1/25程にしか低下せず,むしろKmが約50倍に増加していることがわかった。コンピュータ・グラフィックスで再検討したところ,SerをAlaに置換したことでできる隙間に水分子が侵入して触媒反応が進行する可能性が示唆された。またKmの低下は,Ser130側鎖の-OHが作る水素結合の構造安定性に対する寄与から理解できた。基質が結合するとこの残基の周辺は空間的に狭くなることを考慮して,水分子の侵入をblockできるアミノ酸を調べたところ,ThrとAsn候補として考えられた。現在S130T,S130N変異体を作成し,その触媒特性を検討中である。予備的実験から,S130N変異体ではほぼ完全に活性はなくなるようである。今後これらの変異体で共有結合正四面体中間体の蓄積の有無を直接x線結晶構造解析で解析する予定である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1993

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)