【研究分野】蚕糸・昆虫利用学

【研究領域課題番号】12306003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カイコ / ESTデータベース / 平均化ライブラリー / 神経ホルモン / ジーンターゲッティング / フェロモン / バキュロウイルス / 遺伝子導入 / GFP

【研究成果の概要】

神経ホルモンPBANにより制御されるカイコガ性フェロモン産生系をモデルとして、ホルモンによる昆虫機能発現の分子機構解析を試みた。まず、カイコ純系系統p50フェロモン腺の平均化cDNAライブラリーより構築したフェロモン腺ESTデータベースから浮き彫りにしたフェロモン腺特異的遺伝子の解析を行った。その結果、フェロモン生合成酵素であり、かつ、フェロモン成分の種特異性を規定するキー酵素でもある不飽和化酵素(Desat1)およびアシル基還元酵素(pgFAR)の性質を明らかとし、これら酵素の基質特異性がフェロモン成分の厳密な成分割合の決定に重要な役割を担っていることを示した。これらの成果の一部は米国科学アカデミー紀要(PNAS,2003年8月5日号)に掲載され、その表紙を飾った。また、PBAN受容体遺伝子のクローニングに成功し、これがロドプシン受容体ファミリータイプのGPCRであることを示すとともに、昆虫培養細胞での機能発現を行い、その基本的性質を明らかにした。さらに、メス成虫の血リンパより、フェロモン腺特異的遺伝子pgACBPの転写を活性化する因子を単離し、その構造をβ-グルコシル-O-チロシンであることを明らかにした。
一方、機能発現に関わる昆虫遺伝子の機能を包括的に解析するツールとして、カイコでのジーンターゲッティング法の開発に向けた方法論の確立を試み、Golicらによって開発された相同組み換えによるジーンターゲティング法のカイコへの適用を行った。現在、この手法の実施に必要なFLP部位特異的リコンビナーゼとI-SceIエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックカイコの作成と、標的配列に相同なDNAから成るドナーコンストラクトの構築を進めているが、この最新の形質転換技術をカイコでの系に応用することはノックアウトカイコの作製を可能とするものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2003

【配分額】47,600千円 (直接経費: 40,100千円、間接経費: 7,500千円)

【研究分野】蚕糸学

【研究領域課題番号】02556008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生殖細胞 / カイコ / 細胞移植 / 形質転換 / 細胞融合 / 遺伝子導入 / 種間雑種 / 培養細胞 / エレクトロポレ-ション / 生植細胞

【研究成果の概要】

1.精細胞の移植について、飼育条件による有核精子と無核精子の割合の変化を調べた。その結果、低温暗催青した非休眠性幼虫では無核精子の割合が休眠性幼虫に比べて多いことが明らかになり、現在使用しているB系統に二化性の遺伝子を導入し低温暗催青することにより、より効率のよいドニーの系統をえられることが判明した。
2.カイコの分散型反復配列BMCI多重遺伝子族をベクターとし、クロラムフェニコールアセチル化酵素遺伝子をマーカーとし、熱ショック蛋白質遺伝子のプロモーターをもつプラスミドpBmhscatを構築し、カイコの培養細胞にリン酸カルシュウム共沈法により導入した。その結果、比較的効率よくゲノムDNAと組換えを起こしていることが明らかになった。これを精細胞に応用し、組換え精細胞および組換え体カイコが得られる高い可能性が示唆された。
3.カイコの前胸腺刺激ホルモン遺伝子と休眠ホルモン-PBAN遺伝子について多型を検索し、それぞれ遺伝子座位を決定した。カイコの前胸腺刺激ホルモン遺伝子は第22連関群の2.7に占座し、精細胞移植法によりホモ致死個体が救出されたskuと同一の連関に属し、移植の指標に使えることが明かになった。
4.異種間細胞の移植のため、エリサンの精巣をカイコに移植し移植適性を調べた。その結果、移植された精巣は体液中では消化されるが、精細胞の移植では細胞が健在であることが明らかになった。
5.種間雑種を作り出すため、カイコの培用細胞とマウスの培養細胞の融合条件を検索した。その結果、400v/cmの至適の条件では効率よく融合細胞が得られることが明らかになった。
6.遺伝子導入と細胞融合に用る電気細胞穿孔法の精原細胞への影響を調べた結果、300v/cm以下では精細胞まで分化し移植が可能であった。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1992

【配分額】15,100千円 (直接経費: 15,100千円)