【研究分野】生物生産化学・生物有機化学

【研究領域課題番号】24380060 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物 / ホルモン / 生理活性物質 / コケ / 分化制御 / ヒメツリガネゴケ / ジベレリン / ent-カウレン酸 / 生理活性 / 原糸体 / カウレン / クロロネマ / カウロネマ / 受容体 / P450 / DELLA

【研究成果の概要】

コケ植物の分化促進物質の構造を解明すべく複数のアプローチを並行して進めた。生物検定系を用いた活性物質の精製を主軸に据えて、期中に代謝基質ent-カウレン酸の微量定量法を考案したことが大きく寄与した。独自技術で調製した13C標識ent-カウレン酸と先述の定量法を駆使して活性画分を精査した結果、画分からent-カウレン酸代謝物の由来ピーク検出に成功した。他方、その応答状況から生合成過程への関与が予想されたP450候補遺伝子を特定すべく、順次翻訳産物の酵素活性を調べたが奏功しなかった。そのため、候補遺伝子の破壊株を順次取得して結論が得られるよう対応方針を変えた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2016-03-31

【配分額】17,030千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 3,930千円)

【研究分野】生物生産化学・生物有機化学

【研究領域課題番号】23248018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生理活性 / 植物 / 有機化学 / 農林水産物 / 遺伝子 / 受容体 / 植物ホルモン / ストリゴラクトン / ジベレリン / アゴニスト / アンタゴニスト / D14 / デブラノン / クロストーク / 創薬 / 農薬 / 植物生長調節剤 / DELLAタンパク質 / 加水分解

【研究成果の概要】

新植物ホルモンであるストリゴラクトンは植物の枝分かれを制御する機能を有していることから、その機能の化学的もしくは遺伝子的制御法を開発することにより、穀物の収量増加やバイオマス生産増加に利用することが可能である。本研究では、まず、D14タンパク質がストリゴラクトンを受容後加水分解し、生じたストリゴラクトンD環由来物質が活性本体としてD14と結合した結果、D14とジベレリン情報伝達因子として考えられていたDELLAタンパク質との結合を促進するというメカニズムを明らかにした。またストリゴラクトンミミックとして合成が容易でかつ活性がこれまで用いられていたGR24より活性が高いデブラノン類を開発した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2011-04-01 - 2015-03-31

【配分額】50,050千円 (直接経費: 38,500千円、間接経費: 11,550千円)

【研究分野】生物生産化学・生物有機化学

【研究領域課題番号】18380070 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ジベレリン / 受容体 / シグナル伝達 / 核内リセプター / 核内レセプター

【研究成果の概要】

モデル植物・シロイヌナズナを対象として、ジベレリン受容体3種(AtGID1a,1b,1c)の各翻訳産物を調製し、いずれもが活性型ジベレリン特異的な互いに似た結合様式を示すことを明らかにした。また、多重の機能欠失型変異を導入した植物体の解析から、AtGID1a,AtGID1cに関する2重変異体のみ、他の組み合わせによる2重変異体あるいは、各1遺伝子の機能欠失型変異体では認められない矮性の形質が現れることが明らかとなった。3種のGID1遺伝子の花茎における発現状況には極端に大きな差異が認められなかったことから、AtGID1a,AtGID1c2重変異体でのみ形質が現れる点について、(a)より微細なレベルで比較した場合には他の2種と異なる遺伝子発現パターンをAtGID1bが呈する可能性、(b)AtGID1bが花茎において潜在的に機能が低い可能性が考えられた。そこで酵母を用いて、ジベレリンのシグナルを負に調節するDELLA因子との相互作用状況、あるいは、DELLA因子の分解に関わるF-Boxタンパク質SLY1との相互作用状況に組み合わせいかんで差が認められるか調べた結果、組み合わせの如何に依らず(i)GA依存的にGID1-DELLA間の相互作用が生じること。(ii)SLY1の存在によりGID1-DELLAで形成されていた相互作用が消失することを確認した。従って、酵母を用いた実験系からは上記(b)の可能性を示唆する結果は得られなかった。しかしながら、AtGID1a,AtGID1c2重変異体においてAtGID1b遺伝子を過剰発現させた場合、ある程度までの背丈の回復が認められたものの、野生型植物体と同程度の丈までの回復は望めないことから機能面でAtGID1bが機能しづらい何らかの仕組みが存在することが強く示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】16,900千円 (直接経費: 15,100千円、間接経費: 1,800千円)

【研究分野】生物生産化学・応用有機化学

【研究領域課題番号】14206015 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ジベレリン / ジベレリン結合タンパク質 / ジベレリン受容体 / アズキ / GA2-oxidase / GID1 / 受容体 / Gタンパク質 / GA 2-oxidase

【研究成果の概要】

アズキ黄化芽生えのジベレリン結合活性を示すタンパク質を精製し、20万倍以上の濃縮を達成し、その性質を解析した。このジベレリン結合タンパク質は、活性型ジベレリンのGA_4にたいし、Kd値が10^<-7>Mオーダーの高い親和性を示すとともに、同じく活性型ジベレリンであるGA_1, GA_3に対する親和性もGA_4の10〜20%と高いものであった。一方、GA_4の生合成前駆体であるGA_9や不活性型の3-epi-GA_4に対してはほとんど結合活性を示さず、基質特異性、親和性からジベレリン受容体としての性質を満足していたが、完全な単離には至らず、そのアミノ酸配列を明らかにすることはできなかった。一方、活性型ジベレリンの代謝酵素が同様な基質特異性を示す可能性を検討した。アズキ黄化芽生えに発現しているジベレリン不活性化酵素GA2-oxidaseは3種類あり、その中のVaGA2oxA1は、Co^<2+>存在下でGA_4に対し高い結合活性を示したが、GA_9にも結合活性を示した。さらに、抗VaGA2oxA1抗体を調製し、精製を進めたジベレリン結合タンパク質との交差生を調べたところ、全く交差しなかったことから、ジベレリン家結合タンパク質はGA2-oxidaseとは異なった。本研究期間中に、ジベレリン受容体の特定には至らなかったものの、本研究の成果は、その後、ジベレリン非感受性矮性イネ変異体gid1の原因遺伝子GID1のコードするタンパク質がジベレリン受容体であることを実証するうえで、多大な貢献を果たした。後に、アズキのジベレリン結合タンパク質がイネのジベレリン受容体OsGID1に対する抗体と交差したことから、アズキのジベレリン結合タンパク質は、GID1のホモログであると考えられた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】52,260千円 (直接経費: 40,200千円、間接経費: 12,060千円)

【研究分野】生物生産化学・応用有機化学

【研究領域課題番号】09660121 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アブシジン酸 / ジベレリン / 受容体 / カルシウムチャンネル / 情報伝達 / ABCトランスポーター / 液胞 / 細胞膜 / 植物ホルモン / アリューロン細胞 / 蛍光標識 / シグナル伝達 / cGMP

【研究成果の概要】

大麦アリューロン細胞を用いて、植物ホルモンの受容体の解析と植物ホルモンの作用に阻害的に作用する化合物の合成及びその作用部位についての解析を、併せて開発したセルソーターを用いた植物ホルモン受容体解析手法を用いて行った。まず、植物ホルモンの受容体解析を目標としたビオチン標識化アブシジン酸の合成を4'位にスペーサーを導入することにより行った。この化合物はジベレリンにより誘導されるα-アミラーゼ合成の阻害活性及びアブシジン酸により誘導されるデヒドリンの誘導活性を示すというアブシジン酸と同様の活性を有していたことより、アブシジン酸受容体に作用していることが示唆された。続いてこのビオチン標識アプシジン酸とアリューロン細胞プロトプラストとの相互作用を、蛍光標識アピジンのビオチンへの親和性を利用して、フローサイトメーターを用いて解析した。その結果、アブシジン酸受容体が細胞膜上にあることも示すことができた。またこの解析法を用いることにより、ビオチン標識アブシジン酸結合部位(アプシジン酸受容体)に拮抗的に作用している可能性のある化合物を見出すことができた。さらにカルシウムチャンネル阻害剤のビオチン誘導体を合成し、植物ホルモンの場合と同様の解析を行い、カルシウムチャンネルが細胞膜上にあることも示すことができた。また蛍光標識アブシジン酸・ジベレリンを、アブシジン酸やジベレリンのモデル化合物として用いて、細胞内での局在について検討したところ、液胞へと輸送されることが明らかとなった。また単離した液胞を用いて検討したところ、液胞内への取り込みにはATPが必要であることから、いわゆるABCトランスポーターにより液胞内へと輸送される可能性が示された。
以上、標識化した植物ホルモン誘導体が植物ホルモンの作用部位や蓄積部位を調べる上で有用であることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】化学系薬学

【研究領域課題番号】09672183 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ジベレリン / 受容体 / 光アフィニティー標識 / 蛍光標識 / α-アミラーゼ / 合成 / ブラシノステロイド / ジャスモン酸 / three hybrid system / アリューロン細胞

【研究成果の概要】

活性型天然ジベレリンの中で化学的に比較的安定なGA4或いはGA1を認識部位とする蛍光標識時ジベレリン及びフォトアファニティー標識ジベレリンの設計と合成を目的に合成研究を行った。先ず、ジベレリン母格の化学的安定性を増し適切なスペーサー修飾位置を探る為、種々の誘導体を合成し、大麦の半切り種子を用いたα-アミラーゼ生合成誘導活性試験にてジベレリン活性と検定した。次に、得られた構造活性相関データーに基づき、19-deoxo-GA1型の蛍光標識ジベレリン及びフォトアファニティー標識ジベリンを合成した。現在まで、合成した蛍光標識ジベリンを用いることにより、α-アミラーゼ生合成誘導に関わるジベリン受容体は大麦種子のアリューロン細胞の細胞膜上にあるとの知見を得ている。フォトアファニティー標識ジベリンは外部研究者との共同研究にて受容体タンパク質を含むジジベレリ結合タンパク質の同定研究に用いる予定である。
更に、同一の手法を、近年、植物生長調節物質として注目されているジャスモン酸及び植物ホルモンであるブラシノステロイドの受容体機構解明にも拡張すべく、その構造活性相関研究を行った。その過程で、重水素化ブラシノステロイド、5-エピ-ブラシノライド、6a-carba-ブラシノライド、水酸化ブラシノライド及び、ジャスモン酸誘導体の合成法を開発した。又、最近、受容体タンパク質同定のためのスクリーニング法として提唱されているthree hybrid systemをジベリン受容体同定に応用する目的でGA-dexamethasone hybrid ligandの合成研究を行った。その予備実験としてJA-dexamethasone hybrid ligandを合成した。本研究で行った、スペーサーを介しての様々な機能部位を構築する合成手法は、ジャスモン酸或いはブラシノステロイドの機構探索分子合成の際も、ほぼ同様に適用できるものなので、今後は、これらのプローブの合成も同時進行することを考えている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】化学系薬学

【研究領域課題番号】08672466 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ジベレリン / 受容体 / 光アフィニティー標識 / 蛍光標識 / 合成 / α-アミラーゼ生合成誘導 / アリューロン細胞プロトプラスト

【研究成果の概要】

1.活性型天然ジベレリンであるGA_4の17位に種々のアルキルジチオールをラジカル付加してスペーサーとし、その末端チオールを利用して蛍光標識部位としてfluorescein骨格を導入、数種の蛍光標識GA_4を合成した。これらについて大麦の半切種子及びアリューロン細胞プロトプラストを用いたα-アミラーゼ生合成誘導活性試験を行い、最も活性の高いものとしてFLGA_4-1を選択した。又、これと並行して、先に合成法を確立した17-ハイドロキシGA_4を原料として光アフィニティー標識GA_4並びに蛍光標識GA_4の合成を検討した。その合成迄には至っていないが、合成中間体のα-アミラーゼ生合成誘導活性試験の結果より、化学的安定性並びに活性の面から、GA_4とスペーサーの接合部はFLGA_4-1のイオウ原子よりも酸素或いは炭素原子の方が優れているとの知見を得た。
2.カビの培養により工業的に生産され大量に入手できる天然ジベレリンGA_3をGA_4並びにGA_1誘導体に短工程かつ好収率にて変換する方法を確立した。これにより、原料の量的な確保が可能となり、プローブ分子の合成研究を効率的に進めることができるようになった。又、本変換法の開発過程において、α-ジケトンと酸素の光照射によるエーテルの新酸化反応を見出した。
3.大麦種子のアリューロン細胞プロトプラストを1で合成したFLGA_4-1で処理し、その相互作用をセルソーター及びレーザー共焦点顕微鏡を用いて観察、α-アミラーゼ生合成誘導に関わるジベレリン受容体が細胞膜上にあるとの知見を得た。
4.光アフィニティー標識GA_4及びGA_1の合成は現在検討中である。
以上の結果に加えて、本研究の手法を、近年、植物生長調節物質として注目されているジャスモン酸の受容体機構解明にも拡大すべくその構造活性相関研究を開始した。その過程で、天然ジャスモン酸の定量に有用な重水素標識ジャスモン酸の合成に成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1996

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)