Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

分泌型ホスホリパーゼA_2 / 神経栄養因子 / L型カルシウムチャネル / アポトーシス / PC12 / 小脳顆粒細胞 / 神経突起伸長 / 麹菌 / 神経突起伸張

sPLA_2およびLPCのシグナル伝達においてG2Aが関与するかどうかを検討するため、PC12細胞において内因的に発現しているG2AをRNA interference法によって発現抑制する実験を行った。ラットG2Aに特異的な配列をU6snRNA遺伝子のプロモーターを持つpmU6proベクターに挿入したのち、アデノウイルス発現ベクターpAxcwitに挿入し、目的のアデノウイルス(r2-Ad)を得た。r2-AdをPC12細胞に感染させたところ、内因的なG2Aの発現が抑制されることがRT-PCRにより明らかになった。さらに、r2-Adの感染は糸状菌sPLA_2、LPC、ヒトグループXsPLA_2によるPC12細胞の突起伸長を抑制した。以上の結果より、LPCの遊離を介したsPLA_2の神経栄養因子様作用にG2Aの活性化が関与することが強く示唆された。
一方、麹菌がそのゲノム配列中に持つ2つのsPLA_2遺伝子spaA、spaBの解析を行った。組換えタンパク質を用いて活性測定を行った結果、SpaAは10mMCa^<2+>、pH4-5、SpaBは1mMCa^<2+>、pH7-8に至適条件を持つことがわかった。それぞれに対する抗体を作製し、局在解析を行ったところ、SpaAは大部分が培地中に分泌されるのに対し、SpaBは菌体画分に存在することがわかった。間接蛍光抗体法による観察では、SpaAは細胞壁に局在したが、SpaBは小胞体様の網目状構造、またはlipid bodyに似た粒状の構造体に局在することが分かった。以上の結果から、SpaA、SpaBは単に重複して存在するのではなく、独立した機能を持つことが強く示唆された。

分泌型ホスホリパーゼA_2 / 神経栄養因子 / L型カルシウムチャネル / アポトーシス / PC12 / 小脳顆粒細胞 / 神経突起伸長

我々が見出した糸状菌由来分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)であるp15はPC12細胞の突起伸長を誘導し、また小脳穎粒細胞(CGN)に対してはアポトーシス抑制作用を有する。これらの作用へのPLA_2活性の関与を調べるため、p15の予想活性中心(His57,Asp58)を両方ともアラニンに置換した不活性型変異体p15を作製した。またp15とは比活性の異なるハチ毒由来および放線菌由来sPLA_2の作用を比較した。その結果、変異型p15は上記の生理作用を示さず、また各sPLA_2はそのPLA_2活性の強弱に対応した突起伸長誘導能及びアポトーシス抑制作用を示すことがわかった。
続いて報告されている約10種類のマウスsPLA_2のうち、代表的なグループIB、IIA、V、Xの作用を比較した。その結果、グループVとXにのみ突起伸長誘導活性が認められ、またCGNのアポトーシスもグループXによって抑制された。
次にsPLA_2の作用へのアラキドン酸やエイコサノイド類の関与を調べた。しかし何れもPC12の突起伸長、CGNの細胞死抑制に関与しなかった。一方、PC12細胞に対してはLPCのみ、CGNに対してはLPCとSPCのみがCa^<2+>依存的な突起伸長促進効果あるいはアポトーシス抑制効果を示した。実際、p15処理によってPC12とCGNからLPCが遊離すること、過剰量のアルブミンやホスホリパーゼBの存在下ではp15の効果が抑制されることを確認した。さらに、LPCやSPCをリガンドとするGPCRがPC12細胞やCGNで発現し、p15処理でG2Aのエンドサイトーシスが起こること、G2A高発現PC12細胞株ではp15による突起伸長が促進されることを見出した。以上の結果から、sPLA_2→LPC産生→LPC受容体活性化→→L型Ca^<2+>チャネル活性化→→神経突起伸長・生存維持の経路で情報伝達されることが強く示唆された。

神経突起伸長 / L型カルシウムチャネル / 分泌型ホスホリパーゼA_2 / アラキドン酸 / 小脳顆粒細胞 / アポトーシス / PC12

我々はこれまで糸状菌由来のタンパク質p15がPCl2細胞の分化を誘導し、突起伸長を顕著に促進すること、またpl5が分泌型ホスホリパーゼA_2(sPLA_2)の一種であり、同活性が上記の生物活性に必須であることを明らかにしてきた。本研究期間内においてはpl5の培養マウス小脳顆粒神経細胞(CGN)に対するアポトーシス抑制活性を検討し、sPLA_2が神経栄養因子様の作用を有する可能性について検討した。CGNは生後7日目のマウス小脳より単離し、高カリウム(K^+)培地で培養した。低K^+培地にシフトすることによりアポトーシスを誘導しヘキスト染色を行ったところ、アポトーシス細胞に特徴的な凝集した核形態が観察された。大腸菌で生産した組換えp15を添加した低K^+培地では核凝集が抑制され、またTUNEL陽性細胞も減少したことから、p15にCGNのアポトーシスを抑制する活性があることが分かった。一方、sPLA_2の活性中心と予想されるHD残基をAAに置換した変異型p15では細胞死の抑制が認められなかった。さらに、p15によるCGNからの脂肪酸の遊離と細胞死抑制活性とが相関することを明らかにした。
マウスのcDNAライブラリーよりグループIB, IIA, V, X-sPLA_2をクローニングし、COS1細胞に融合タンパク質として発現させた。培養上清をPC12細胞に与えたところ、IB, IIAは突起を伸長しなかったが、V, Xは突起伸長活性を有していた。次に、上記の4つに加えてマウスグループIIEをクローニングし、合わせて合計5種類のマウスsPLA_2について大腸菌で発現させ、S-S結合の再生処理行って活性型の精製タンパク質を得た。これらのマウス小脳顆粒細胞に対する生存維持活性を検討したところ、少なくともXについては生存維持活性が認められ、BDNF・IGF-1による生存維持を増強することが明らかとなった。