【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】07760077 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カルシウム / 超ラセン構造 / RNaseE / cafA / 16S rRNA / エンドリボヌクレアーゼ

【研究成果の概要】

1 SH3450株のカルシウム依存的増殖にかかわる遺伝子(cal)はP1トランスダクションによりargHとrpoBの間(約90分)にあることが示されたが、この領域のどのDNA断片によっても相補されず、優性変異であることが示唆された。cal変異株はDNAジャイレースの阻害剤ノボビオシンに高感受性を示し、DNAの超ラセン構造が弛緩していることが示唆された。
2 RNaseEの変異株amslの温度感受性がcafAプラスミドによって部分的に回復されること、amsl cafA::catの二重変異株ではその温度感受性が増強されることを見い出した。アルコールデヒドロゲナーゼadhEとcafA::catの二重変異株は生存可能であった。cafA::cat株では16S rRNAの前駆体である16.3 S rRNAが蓄積しており、cafAプラスミドの導入によって回復されることを見い出した。またamsl変異株では16.3Sよりやや大きめの前駆体16.5Sが蓄積していた。リファンピシンを用い新規RNA合成を止めた実験より、CafAとRNaseEはそれぞれ互いの認識部位を切断する活性を弱いながらも持っていることが示された。16S rRNAのプロセッシングの変異株として取られ、その後解析が行われていなかったBUMMER変異株がcafAの変異株であることを明かにした。これらのことよりCafAは16S rRNAの成熟過程にかかわるRNaseE様のエンドリボヌクレアーゼであることが示唆された。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1995

【配分額】1,100千円 (直接経費: 1,100千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】06760076 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カルシウム / 細胞骨格 / cafA / アルコールデヒドロゲナーゼ / pcsA / SOS / dinD / rpoB

【研究成果の概要】

培地中の高濃度のカルシウムによって生育が阻害される大腸菌変異株CS2-29と、高温での増殖が培地中のカルシウムに依存的になる変異株SH3450の解析を行った。CS2-29株のカルシウム感受性にかかわる変異を相補する遺伝子を、コスミドベクターを用いてクローン化した。得られたクローンはKoharaの大腸菌染色体整列クローンに対するハイブリダイゼーションによって大腸菌染色体地図上48分にマップされた。CS2-29株ではカルシウム処理により染色体DNAの断片化が引き起こされることを見い出した。同様に、SH3450株のカルシウム依存的増殖にかかわる遺伝子についてコスミドクローンを分離した。得られたクローンは90分にマップされた。サブクローニングの結果、RNAポリメラーゼβサブユニットをコードするrpoB遺伝子により温度感受性が回復されることがわかった。しかし、P1マッピングによりSH3450株はrpoB変異の他にもう一つの変異をもっていることが明らかとなった。
過剰発現により細胞内に細胞骨格様構造体を形成するcafA遺伝子の破壊株cafA::cat株において、分子量100Kの蛋白質が過剰発現していることを見い出した。100K蛋白質のN末のアミノ酸配列を決定したところ,AdhE(アルコールデヒドロゲナーゼ)であることが明らかとなった。
変異により低温で染色体分配異常を引き起こすpcsA遺伝子を、Koharaの大腸菌染色体整列クローンよりクローン化した。pcsA遺伝子はSOS遺伝子の一つであるdinD遺伝子と同一であることが明らかとなった(J.Bacteriol.,177:156-165,1995)。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1994

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】05760063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大腸菌 / cafA / RNaseE / ams / mukA / カルシウム / 細胞周期

【研究成果の概要】

cafA遺伝子の破壊株cafA::catを構築し、その細胞分裂や染色体分配に異常がないことを落射蛍光顕微鏡により確認した。cafA遺伝子と相互作用する因子を細胞分裂変異株の中から検索した。その結果、RNaseEの変異株ams1の温度感受性がcafAプラスミドによって部分的に回復されることを見い出した。また、ams1 cafA::catの二重変異株ではその温度感受性が増強されていた。これは、CafA蛋白質がRNaseE様の活性を持つことを示唆している。さらに、mukA変異株がcafAの過剰発現により死滅することを見い出した。同様な性質を示しmukAプラスミドによって部分的に回復するM21株を新たに分離した。
大腸菌の細胞周期におけるカルシウムの役割を明らかにするために、培地中のカルシウムに対して異常な反応を示す変異株を探索した。その結果、カルシウム感受性を示すCS2-29株、カルシウム依存性を示すSH3450株を分離した。CS2-29株のカルシウム感受性にかかわる変異を相補する遺伝子を、コスミドクローンを用いてクローン化した。クローン化した遺伝子をプローブとしてKoharaの大腸菌染色体整列クローンに対してハイブリダイゼーションを行うことによってマッピングした。同様に、SH3450株のカルシウム依存的増殖にかかわる遺伝子について、クローン化、マッピングを行なった。今後、得られた遺伝子の構造決定、遺伝子産物の同定を行なう予定である。さらにカルシウムに関する変異株を探索し、いくつかの候補株を得た。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1993

【配分額】900千円 (直接経費: 900千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】05453161 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヒストン様蛋白質 / H-NS / 細胞周期 / カルシウム / 細胞骨格様蛋白質 / cafA / ams / rRNA / アルコールデヒドロゲナーゼ / oriC / DNA gyrase / 超ラセン構造 / 大腸菌

【研究成果の概要】

1 大腸菌のoriC-膜複合体中にヒストン様蛋白質H-NSを抗H-NS抗体を用いて検出した。さらにその欠失変異体は、野性株と比べて高頻度に無核細胞を放出し、細胞あたりの核数(ploidy)が減少していることを見い出した。これはH-NSが染色体の複製と分配において重要な役割を果たしていることを示唆している。
2 大腸菌の細胞周期におけるカルシウムの役割を明らかにするために、培地中の高濃度のカルシウムによって生育が阻害される変異株CS2-29と、高温感受性が抑制される株SH3450を分離し、その解析を行った。CS2-29株のカルシウム感受性にかかわる変異を相補する遺伝子を、コスミドベクターを用いてクローン化した。得られたクローンは大腸菌染色体地図上48分にマップされた。同様に、SH3450株のカルシウム依存的増殖にかかわる遺伝子についてコスミドクローンを分離した。得られたクローンは90分にマップされた。現在、これらのクローンからカルシウムに関わる遺伝子のサブクローニングを行っている。
3 過剰発現により細胞内に細胞骨格様構造体を形成するcafA遺伝子の機能を明らかにするためにcafA遺伝子の破壊株cafA::catを構築した。RNaseEの変異株ams1の温度感受性がcafAプラスミドによって部分的に回復されること、ams1 cafA::catの二重変異株ではその温度感受性が増強されることを見い出した。cafA::cat株では16S rRNAの前駆体である16.3S rRNAが蓄積しており、cafAプラスミドの導入によって回復されることを見い出した。これらのことよりcafAは16S rRNAの成熟過程にかかわるRNaseE様のエンドリボヌクレアーゼであることが示唆された。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1993 - 1995

【配分額】7,400千円 (直接経費: 7,400千円)