Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

我々は、Thermusでは、リジンがジアミノピメリン酸を介さない経路(αアミノアジピン酸経路)で合成されることを見いだした。しかしながら、その経路がカビ・酵母で見られるものと異なり、経路の後半はアルギニン生合成と似た反応によることを示唆してきた。これまでに行ってきた生合成経路の解析により、リジンは2-オキソグルタル酸から10段階の反応を経て合成されると予想される。まだクローニングができていなかった2つ、ホモイソクエン酸からαケトアジピン酸を生成するホモイソクエン酸脱水素酵素、そしてその次の過程であるαアミノアジピン酸への変換を触媒する酵素をコードする遺伝子のクローン化を行った。前者に関しては、ホモイソクエン酸脱水素酵素がイソクエン酸脱水素酵素やイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素とアミノ酸配列の相同性があることが予想されるため、両遺伝子の内部配列を基にdegenerate primerを作製し、クローン化することとした。後者に関しては、哺乳動物のαアミノアジピン酸アミノ基転移酵素の配列を参考にして、同様にPCRを用いてクローン化することとした。クローン化した遺伝子の破壊株を作製し、栄養要求性を調べたところ、ホモイソクエン酸脱水素酵素遺伝子の破壊株においては、明瞭なリジン要求性が、αアミノアジピン酸アミノ基転移酵素遺伝子の破壊株においては、部分的なリジン要求性が見いだされた。ホモイソクエン酸脱水素酵素遺伝子について大腸菌での大量発現系を構築し、精製酵素を用いて、基質特異性を決定するアミノ酸残基を同定した。また、系の初発酵素であるホモクエン酸合成酵素についても研究を行い、同酵素がクエン酸合成酵素としても機能しうること、そしてリジンによって強い阻害を受けることなどを明らかにした。