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Thermus属細菌 / リジン生合成 / 基質特異性 / X線結晶構造解析 / 分子進化工学 / 転写調節 / 生合成 / アミノ酸 / 酵素 / 進化 / 微生物 / 気質特異性

1)Thermus thermophilusにおいて、ホモアコニターゼの酵素学的諸性質を解析し、同酵素が第3番目の反応を触媒出来るものの、第2番目については触媒出来ないことを明らかにした。2)αアミノアジピン酸アミノ基転移酵素(AAA-AT)について、ピリドキサールリン酸(PLP)複合体構造、およびPLP+ロイシン複合体構造などをX線結晶構造解析により決定した。AAA-ATは、リジン生合成の基質である2-オキソカプロン酸だけでなく、ロイシン生合成、フェニルアラニン生合成の対応化合物に対しても高い活性を有している。その基質認識機構を、タンパク質の立体構造決定することにより解析した。稼働性が高いN末端のα1ヘリックスが基質側鎖の性質に応じて移動すると同時に、同ヘリックスに存在するArg残基が活性発現に重要な役割を持っていることを明らかにした。3)DNAシャッフリングにより、ロイシン生合成の対応基質2-イソプロピルリンゴ酸に対して高い活性を示す改変型ホモイソクエン酸脱水素酵素を作製した。得られた酵素、および導入された個々の置換の効果を解析し、それら何れの置換も基質特異性の変換に効果があることが明らかにした。4)AAAのαアミノ基の修飾を行う酵素LysXについて、T.thermophilus HB27株のもの、およびSulfolobus tokodaiiのLysXパラログについて、結晶化に成功した。5)主要リジン生合成酵素遺伝子クラスターの転写はリジンによって制御されていることを明らかにした。その様式は大腸菌のtrpオペロンに類似したattenuation機構であった。さらに、同クラスターの転写はアルギニン生合成転写調節因子ArgRおよびプロリン代謝転写調節因子PutRによっても制御されていることを明らかにした。

リジン生合成 / Thermus thermophilus / αアミノアジピン酸 / 基質特異性 / アルギニン生合成 / 進化 / リジン生合成経路 / トリカルボン酸回路 / アルギニン生合成経路

我々は、Thermusでは、リジンがジアミノピメリン酸を介さない経路(αアミノアジピン酸経路)で合成されることを見いだした。しかしながら、その経路がカビ・酵母で見られるものと異なり、経路の後半はアルギニン生合成と似た反応によることを示唆してきた。これまでに行ってきた生合成経路の解析により、リジンは2-オキソグルタル酸から10段階の反応を経て合成されると予想される。まだクローニングができていなかった2つ、ホモイソクエン酸からαケトアジピン酸を生成するホモイソクエン酸脱水素酵素、そしてその次の過程であるαアミノアジピン酸への変換を触媒する酵素をコードする遺伝子のクローン化を行った。前者に関しては、ホモイソクエン酸脱水素酵素がイソクエン酸脱水素酵素やイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素とアミノ酸配列の相同性があることが予想されるため、両遺伝子の内部配列を基にdegenerate primerを作製し、クローン化することとした。後者に関しては、哺乳動物のαアミノアジピン酸アミノ基転移酵素の配列を参考にして、同様にPCRを用いてクローン化することとした。クローン化した遺伝子の破壊株を作製し、栄養要求性を調べたところ、ホモイソクエン酸脱水素酵素遺伝子の破壊株においては、明瞭なリジン要求性が、αアミノアジピン酸アミノ基転移酵素遺伝子の破壊株においては、部分的なリジン要求性が見いだされた。ホモイソクエン酸脱水素酵素遺伝子について大腸菌での大量発現系を構築し、精製酵素を用いて、基質特異性を決定するアミノ酸残基を同定した。また、系の初発酵素であるホモクエン酸合成酵素についても研究を行い、同酵素がクエン酸合成酵素としても機能しうること、そしてリジンによって強い阻害を受けることなどを明らかにした。