Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

電子伝達 / 部位特異的変異 / 銅蛋白質 / 蛋白質間相互作用

我々は脱窒菌Alcaligenes faecalisS-6株の亜硝酸還元酵素への電子伝達物質として同菌より青色同蛋白質シュードアズリンを発見し、銅蛋白間での電子伝達を世界で初めて示すと共に、これら銅蛋白間の電子伝達機構についての解析を行ってきた。本研究では、亜硝酸還元酵素が保持する2種類の銅原子の中で、タイプ1銅配位子の改変体Met150Glu、タイプ2銅配位子の改変体His135Lysに対して、シュードアズリンおよびメチルビオロジェンを電子供与体として速度論的解析を行った。メチルビオロジェンを用いた場合、Met150Gluでは酵素活性が検討されたが、His135Lysでは活性が全く検出されず、タイプ2銅が活性に関与することが明らかになった。さらに、シュードアズリンを用いた場合には、Met150Gluのシュードアズリンに対する見かけの親和性にはほとんど変化が観察されないものの、電子伝達活性は1/1000に大幅に低下していた。これらの事実から、亜硝酸還元酵素のタイプ1銅がシュードアズリンから電子を受け取り、タイプ1銅から電子を渡されたタイプ2銅が活性に関与することが明らかなった。シュードアズリンの銅原子の周囲の分子表面に多数のLys残基が存在しており、これらのアミノ酸残基が亜硝酸還元酵素との相互作用を担うことが示唆された。そこで、シュードアズリンの9個のLys残基を1つずつAlaまたはAsp残基に置換して、亜硝酸還元酵素との相互作用を調べたところ、との改変体も亜硝酸還元酵素への電子伝達活性には影響を与えなかったが、タイプ1銅に近い変異のみが親和性を大きく低下させることが明らかになった。これらの結果から、シュードアズリンは自身の銅原子を亜硝酸還元酵素に向けて、Lys残基を介した静電的相互作用により亜硝酸還元酵素と相互作用していることが示された。

亜硝酸還元酵素 / 蛋白工学 / 部位特異的変異 / 脱窒 / 電子伝達 / 銅蛋白

活性汚泥から単離した脱窒菌Alcaligenes faecalis S-6株において、同菌の脱窒の一過程を担う亜硝酸還元系は、亜硝酸還元酵素(NIR)およびシュードアズリンという二つの銅蛋白によって構成されている。同様な銅蛋白による亜硝酸還元系は後になって微生物からカビにわたって広く分布することが明かとなってきた。しかしながら今までに蛋白の銅配位環境と蛋白としての機能の関係、さらには二つの銅蛋白の銅原子間でどのように受け渡しされるのかについては全く明らかになっていなかった。本研究では蛋白工学的に蛋白を改変しそれらの性質を調べることで銅蛋白の構造と機能および銅蛋白間の電子伝達機構を明らかにすることとした。まず、そのための前段階として大腸菌でのNIR遺伝子の発現の最適化を行った。その結果、改変した分泌シグナルをNIR遺伝子に連結し、lacプロモーターの制御下、25-30・Cの低温で培養することにより、1リッター当たり3mg程度のNIRを大腸菌ペリプラズムに分泌する系を確立することに成功した。この系を用いて、NIRがサブユニット当たり1原子ずつ保持しているタイプI銅、タイプII銅の銅原子配位座(リガンド)のうち、タイプI銅リガンドのMet150をGluに、タイプII銅リガンドのHis135をLysに改変した酵素を作製、精製した。Met150Glu改変体は予想どおりタイプI銅を欠失していたが、His135Lys改変体はタイプIIリガンドのうちの1つが変化しているにも関わらず、タイプI、タイプIIの両方の銅を結合していることが明らかになった。次に、これらの改変体の活性を低分子のメチルビオロジェンを電子供与体として用いて測定したところ、His135Lysでは全く活性が検出されない一方、Met150Glu改変体では、十分な亜硝酸還元活性が検出された。これらの結果から、NIRにおいてはタイプII銅が活性に直接的に関わることがはじめて直接的に明らかになった。また、シュードアズリンの銅の周辺に位置するLys残基を中性または酸性残基に変換したところ、Lys10およびLys38の改変により、NIRへの電子伝達能が大きく低下することが明らかになりつつあり、シュードアズリンの銅原子周辺が、NIRと直接的に相互作用していることが示唆された。現在、NIRに含まれるタイプI銅の役割および、シュードアズリンのLys改変体を用いた、NIRとシュードアズリンの相互作用様式の解析を進めている。