Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

細胞融合 / マイクロ流路 / 指向性進化 / 淘汰 / マイクロ電極

本年度は、細胞融合に必要な①細菌のプロトプラスト化、②プロトプラストの電気的細胞融合、細菌の嗜好性進化に必要な③繰り返しストレス印加技術の開発に取り組んだ。
①細菌のプロトプラスト化：乳酸菌(L. lactis)の懸濁液に対して、細胞壁を溶かすリゾチームを10 mg/ml, ムタノリシンを30 ug/mlを加え、1時間で細胞壁を溶かした。乳酸菌の大きさは1.2 umから1.0 umに減少したことから、細胞壁を除去したと判断した。しかし、細胞壁の除去が不十分である可能性は否めず、杆菌である枯草菌に菌種を変え同様の操作を行った。桿状形状が円形に変わったため、細胞壁を十分に除去し、プロトプラスト化できたことを確認した。
②プロトプラストの電気的細胞融合:Pt対向電極間に4.0 Vpp、40 MHzの交流電圧を印加することで正の誘電泳動が生じ、誘電泳動によりバッファー内のプロトプラストを電極間に捕獲し、プロトプラスト対を形成した。50 kV/cm、パルス幅0.5 ms、周波数20 Hzで電極間に存在したペアのプロトプラストが破裂することを確認した。
③繰り返しストレス印加技術の開発:指向性進化デバイスにおいて液滴を分割し、チャンバ内に分割液滴を輸送し、チャンバ内で細菌を淘汰した後に入り口に運ぶことが繰り返しに必要とされる。そこで、液滴を高淘汰圧のチャンバ内液滴から順番に入り口に輸送するための技術を開発した。チャンバに接続する流路を一つの空気圧を印加する流路に接続し、それらの幅を淘汰圧が高いほど広くした。これにより、接続流路に圧力を印加する際に液滴に加わる力を変えた。3つのチャンバに接続流路幅500 um, 25 um, 15 umとした上で、空気圧を徐々に増大させたところ、高淘汰圧のチャンバ内液滴から順に1.7 kPa, 2.7kPa, 3.4 kPaで液滴を入り口に輸送できた。

温度勾配チャンバ / 直列式マイクロヒータ / 淘汰 / 突然変異 / 走化性 / 形質転換 / マイクロ流路 / 自然淘汰

突然変異→自然淘汰→繁殖といった進化の各ステップをマイクロ流路機能として再現し、それらを直列に接続することで、微生物に進化の過程を与え、特定の方向性をもって形質を変化させるためのマイクロ流路技術を開発した。突然変異には変異原として紫外線を用いることが効果的であることを調べた。自然淘汰においては、今回は淘汰圧として熱を選択し、並列したチャンバに対して直列で各チャンバ位置の抵抗が異なるマイクロヒータを設置することで異なる温度のチャンバを実現した。これを用いて一度に複数の温度化において大腸菌の遊走能の違いを調べることができた。繁殖に関しては、淘汰の直前に行うことが望ましいことが分かった。

今回のマイクロ流路デバイス開発において、大腸菌に熱耐性を与えるために必要となる進化の要素機能の開発を行った。今回開発した要素機能を接続し、複数回のサイクルを回すことで、大腸菌に熱耐性を与えることが可能となると考える。大腸菌の有機物生産において、発熱に対して有機物生産効率が低下することを防ぐための冷却コストが有機物価格を引き上げる一つの原因となっているため、高温でも有機物生産効率が低下しない大腸菌を作り出すことは重要である。今回、熱耐性を獲得できれば、他のパラメータに対しても進化サイクルを回すことが可能となるため、多岐にわたる選択圧を選ぶことで、様々なパラメータに対する高耐性大腸菌を作り出せる。

【研究分担者】
金子真也	東京工業大学	生命理工学院	助教	(Kakenデータベース)