Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

超好熱菌 / Thermococcus / 水素生産 / TCA回路

超好熱性アーキア / Thermococcus / 代謝改変 / 水素 / 微生物工学 / 超好熱菌 / アーキア / TCAサイクル / メタボローム解析 / 生物・生体工学 / 水素生産

絶対嫌気性超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisはデンプンやピルビン酸の酸化分解と共役したプロトン還元により水素を発生させるが、これら基質はアセチル-CoAを経て最終的に酢酸として排出される。T. kodakarensisはC6カルボン酸を変換する酵素群を有しておらず、アセチル-CoAを代謝するTCAサイクルは機能していないと考えられているが、これら酵素群を有している超好熱菌も存在する。本研究では、T. kodakarensisに超好熱菌由来の耐熱性C6カルボン酸変換酵素群を導入し、TCAサイクルを駆動させることによる生育および物質生産能への影響を解析した。

超好熱菌 / 機能未知遺伝子 / 遺伝子破壊 / 始原菌 / 新規代謝系 / ゲノム / Thermococcus / 比較ゲノム / ゲノム科学 / 遺伝子機能解明 / DNA chip / proteome

1.超好熱菌遺伝子破壊系の改良
ΔpyrF株を宿主とし、pyrFマーカー遺伝子の上流および下流に相同領域を導入することにより、一段階目の相同組換えの後にpyrFマーカー遺伝子がゲノム上から脱落する系を開発した。この系では原理的には如何なる数の遺伝子でも破壊・導入が可能となる。
2.中央代謝経路の解明
炭素中央代謝に着目し、ゲノム情報からその存在が不明であった多数の遺伝子を特定した。
(1)我々は超好熱菌ゲノム上でそれまで特定されていなかった糖新生経路の鍵酵素はfructose 1,6-bisphosphatase(FBPase)遺伝子を同定し、遺伝学的にその機能も証明した。
(2)本菌の解糖系の最終反応が一般的なpyruvate kinaseではなく、phosphoenol-pyruvate synthaseにより触媒されていることを遺伝学的に証明した。
(3)今まで知られていた経路と異なる構造的に新規な3種の酵素から構成される新しいキチン分解経路を発見した。
(4)T.kodakaraensisではribulose monophosphaIe pathwayの逆反応がpentose合成を担っていることを発見し、従来のpentose phosphate pathwayに代わる始原菌特異的なpentose合成経路を明らかにした。
以上の研究成果によりT.kodakaraensis K0D1の中央炭素代謝のほぼ全容が明らかとなった。
3.Reverse gyrase paradoxの解決
Reverse gyraseは唯一の超好熱菌固有の酵素である。Reverse gyraseの特徴的な構造と本酵素が超好熱菌の生育に必須であると考「えられてきたことから、生命が超好熱菌として誕生したという説は否定されていた。我々はreverse gyrase遺伝子の破壊株を取得することに成功し、破壊株が90℃で生育することを見いだした。したがって、reverse gyraseが存在しない条件であっても生命が高温環境(90℃)で誕生し得たことを実験的に証明した。
4.Type III Rubiscoの機能解明
Type III RubiscoはCalvin回路を持たないArchacaにのみ存在し、Rubiscoのcarboxylase活性を示すものの、その生理的役割は不明であった。我々は比較ゲノム的アプローチよりT.kodakaraensis内でAMPからType III Rubiscoの基質ribulose1,5-bisphosphateを供給できる2種の新規酵素AMP phosphorylaseおよびribose 1,5-bisphosphate isomeraseを同定した。この代謝経路は糖新生系の一部とpentose phosphate pathwayの一部と合わせて新しい第5の炭酸固定経路を形成し得ることも判明した。

炭酸固定 / Rubisco / ATP-citrate lyase / ビオチン / カルボキシラーゼ / 超好熱菌 / 始原菌 / Thermococcus / archaea / 嫌気的炭酸固定 / リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ / RuBisCO

HD-1株において、4種類のbiotin化タンパク(130kDa-BP、120kDa-BP、70kDa-BP、19kDa-BP、BP=Biotinylated Protein)の存在が示唆された。120kDa-BPの遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した結果、推定分子量121.4kDa、1154aaをコードする3462bpから成る単一のORF上に、acetyl-CoA carboxylaseに特徴的な3つの機能であるbiotin carboxylase(BC)、biotin carboxyl carrier protein(BCCP)およびcarboxyltransferase(CT)遺伝子と相同的な領域が存在することが判明した。In vitroでは本酵素はacetyl-CoA carboxylase活性を有した。
超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1のゲノム上に存在するRubisco様遺伝子が、実際に高い炭酸固定能を有する酵素をコードしていること、および本遺伝子が転写翻訳され、Rubiscoがタンパク質としてKOD1株内に存在していることを明らかにした。超好熱始原菌由来Rubiscoがlarge subunitのみから構成されること、および新規な10量体、五角形構造を有することを明らかにした。さらに、組換え型Tk-Rubiscoの結晶化に成功し、X線解析の結果、2.8Angstromの分解能で本酵素の立体構造を明らかにした。
我々はまたChlorobium limicolaを題材として、原核生物のATP-citrate lyase遺伝子を単離し、本酵素の構造を明らかにした。既存のATP-citrate lyaseと異なり、原核生物のATP-citrate lyaseが2つのpolypeptideからなるhetero-enzymeであること、活性には両subunitが必須であることを明らかにした。また、原核生物のATP-citrate lyaseがcitrate synthase活性をもたないことを示した。また、oxaloacetate、ADPにより酵素活性が阻害されることから、本酵素が還元的TCA回路の回転方向や速度を調節していることを示した。

【研究分担者】
折田和泉	東京工業大学	生命理工学院	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
金井保	京都大学	工学研究科	助手	(Kakenデータベース)
跡見晴幸	京都大学	工学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
福居俊昭	京都大学	工学研究科	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
福居俊昭	京都大学	工学研究科	助手	(Kakenデータベース)

【研究協力者】
野原健太