Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

アルカリ性土壌 / 耐塩性機構 / マイクロアレイ / 耐性植物 / ストレス耐性 / トランスポーター / アンチポーター / ナトリウム

前年度の研究の結果、中国東北部のアルカリ塩類集積土壌に野生するPuccinellia tenuifloraおよびChloris virgataにおける高度の耐塩性機構に関与する事が予想された遺伝子について詳細な解析を行った.特に、Na+/H+アンチポーター(NHA、 NHX)、カリウムトランスポーター(HKT)、細胞膜PMP3タンパク質(PMP3)、DREBタンパク質およびカリウムチャンネルの遺伝子(cDNA)の全長を単離し、解析した.最初にそれぞれの遺伝子の環境ストレスに対する発現応答について調べた.多くの遺伝子は環境ストレス処理に応答して発現が変化する事から、ストレスに対する植物の応答に関与する事が考えられた.次にそれらの遺伝子を酵母発現用のベクターに組み込みこんだプラスミドを構築し、酵母(Saccharomyces cerevisiae)に導入した.その結果、酵母でそれらの遺伝子を高発現させる事により、酵母のストレス耐性(塩、高浸透圧等)が向上する事が明らかになった.そこで、それらの遺伝子をpBI121ベクターのCaMV35Sプロモーターの下流に挿入した植物形質転換用プラスミドを構築し、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナ(系統:Columbia)に導入した.その結果、ほとんどの形質転換シロイヌナズナの耐塩性、高浸透圧耐性、活性酸素発生薬品耐性、低温耐性、乾燥耐性が向上する事が確認できた.またNHAとNHXについてはpActNOSベクターのイネアクチンプロモーターの下流に遺伝子を挿入したプラスミドを構築し、イネ(品種:日本晴)に導入した.形質転換イネの耐塩性について現在解析を進めている.

ディファレンシャルディスプレイ / イネ / いもち病 / 抵抗性 / ストレス耐性 / アルカリ性土壌 / 耐病性

前年度までの成果から、ディファレンシャルディスプレイ法が、特定のストレス条件に対して発現応答する遺伝子のクローニングに非常に有効であることが分かったので、この方法をアルカリ性土壌(炭酸塩集積土壌)において特異的に発現する遺伝子のクローニングに応用した。発芽後1週間のイネ幼植物に炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムによるストレスを与えた後にサンプリングし、RNAを抽出した。RNAを鋳型としてランダムプライマーを用いてcDNAを合成し、そのcDNAを鋳型としてRAPDプライマーを用いたPCRを行った。SDS-PAGEで分離した後、銀染色でバンドを検出した。コントロールのサンプルと比較することによって、ストレス下で特異的に発現している遺伝子cDNAのバンドを切り出し、その抽出液を鋳型とした再PCRの後プラスミドベクターにサブクローニングした。部分的に決定した塩基配列をもとにデータベースを検索し、cDNAの同定を行い、必要に応じて5'・3'-RACE法で全長のcDNAを得た。そのうちのいくつかのクローンについて全塩基配列を決定した。その中でリンゴ酸酵素、ヒートショックプロテインおよび未登録のcDNAが得られ、それらのストレス特異的な発現がノーザンブロットによって確認できた。リンゴ酸酵素は、細胞内pHの調節に大きく関わる酵素であり、本研究の結果もストレス下の細胞内pHの調節と関連があると考えられた。そこで、リンゴ酸酵素の他に細胞内pHの調節に関わると考えられるPEPCase、炭酸脱水酵素遺伝子等のストレス下の発現応答について詳細に解析した。