Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

神経線維 / 樹状突起 / 軸索 / カルシウム / スパイン / 脳・神経 / 神経細胞 / イメージング / 神経科学

光学測定系を工夫・改善し、300個以上のシナプスから100 Hzという高速での撮影を可能にした。この革新的な新技術を用いて、
i）海馬CA3野樹状突起の回路演算様式を解析した結果、興奮性入力と抑制性入力のバランスが線維の局所では崩れていることを見出した。この結果はCell Report誌で発表した。
ii）経験によって一度活動したCA1野神経細胞は、上流のCA3野からの精密な軸索回路による特異的入力によって再活性化すること、また樹状突起イメージングを行うことで、この再活動そのものを繰り返すことによって再活性化する細胞セットの精度が高まることを発見した。この結果はScience誌に報告した。

分子動態 / タンパク質 / 神経細胞 / シナプス / 活動電位 / 膜電位計測 / 樹状突起 / スパイン / ２光子励起顕微鏡 / 蛍光相関分光法 / 拡散 / 2光子励起顕微鏡 / 分子・細胞神経科学 / タンパク質の動態

新規に開発した2光子励起顕微鏡システムを用い多点で同時に蛍光相関分光法(FCS)を適用することにより、1) 神経細胞樹状突起の細胞質中を高速に移動するタンパク質分子の動態を捉えること、および2) 神経細胞の膜電位計測を同時多点で行うことを目的とした。GFP発現プラスミドあるいはGFP融合CamKIIタンパク質発現プラスミドをマウス由来初代培養神経細胞に発現させ細胞質の複数点から蛍光強度変化の記録を10kHz以上の時間解像度で取得しFCS解析することに成功した。また、複数培養神経細胞から同時に活動電位記録を取ることに成功し、神経細胞のシナプス結合の有無および結合の方向性について解析を行った。

樹状突起棘 / 細胞骨格 / ドレブリン / アクチン / 発達 / 老化 / シナプス成熟 / 神経発達 / 神経培養 / 神経細胞 / 樹状突起 / スパイン / シナプス / グルタミン酸受容体 / 海馬 / アクチンフィラメント / 遺伝子導入

(A)スパイン細胞骨格蛋白群の解析
ドレブリン特異抗体を固定化したビーズを用いて樹状突起スパインの細胞骨格蛋白群を調整すると、ドレブリンの他、アクチン、3種のミオシンとゲルゾリンがその中に含まれるていたが、さらに多くの未同定蛋白が含まれていることが蛋白電気泳動法により確認された。そこでこの標本を免疫源としてモノクローナル抗体を作製したところ、脳に特異的なミオシン用蛋白を認識する抗体(文献13)、神経細胞が分泌する細胞外基質を特異的に認識する抗体、カルモデュリンカイネースを認識する抗体がとれた(口頭発表11、13)。
(B)発達・老化に伴うスパイン細胞骨格系の変化
発達過程のラット大脳におけるドレブリンのアイソフォーム変換と樹状突起スパインヘの局在化を、経時的に調べた。(1)発達初期ではドレブリンは細胞体膜直下及び突起に連続性に分布しているが、発生が進むに従い、ドレブリンはクラスタリングすることがわかった。(2)次に、発達過程のラット大脳におけるドレブリンのアイソフォーム変換についてウェスタンブロッティングにより調べた。その結果、ドレブリンAの発現増加はドレブリンのクラスタリング時期と一致する事がわかった。(3)ドレブリンのクラスタリングはNMDA受容体活性に依存性であることがわかった(口頭発表4,7)。(4)また、このドレブリンAの発現増加に並行して、アクチン非結合型のドレブリンが激減することが観察された(口頭発表22)。従って、ドレブリンの樹状突起スパインヘの局在化は、RNAプロセッシングの変化により、ドレブリンのアイソフォームが成熟型となり、アクチンに対する結合活性が変化することにより引き起こされると推定された。(5)GFP融合ドレブリンを初代培養神経細胞に発現させたところ、スパインの長さが長くなることを発見した(文献9)。

【研究分担者】
斉藤佳子	群馬大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
林謙介	群馬大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
関野祐子	群馬大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)