【研究領域課題番号】21H03339 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

歩行 / スプリットベルトトレッドミル / 適応 / 運動学習 / 小脳 / 下オリーブ核 / マウス / ラット / 肢間協調 / 登上線維 / 誤差情報

【研究成果の概要】

本研究では、左右分離型ベルトトレッドミルにおける歩行運動の適応において、小脳皮質プルキンエ細胞への下オリーブ核－登上線維系による誤差信号の時空間的な情報表現について、統計的機械学習技術を適用し、運動学的データにおける潜在的な説明変数を抽出し、被説明変数としての登上線維系がプルキンエ細胞に伝送する信号の活動パターンとの関係性について定量的に明らかにすることを目標としている。
新たに開発したマウス用の左右分離型ベルトトレッドミルを用いて、マウスの4足歩行時に左右のベルト速度を同一にしたtied-belt条件と左右で異なるベルト速度のsplit-belt条件での四肢の歩容解析を深層学習技術を適用して行った。その結果、マウスの4足歩行時において、tied-belt条件からsplit-belt条件へ移行した際の左右における肢間協調は前肢と後肢とでは質的に大きく異なり、特に、左右の前肢間における時間的協調について適応・学習の動態が明らかにされた。
ラット用左右分離型ベルトトレッドミルを用いて、ラットの後肢2足歩行時に、左右のベルト速度を同一にしたtied-belt条件から左右で異なるベルト速度のsplit-belt条件へ移行した際の運動学的特徴について3次元モーションキャプチャシステムを用いて解析した。それらの結果として、ヒト及びネコなどを用いた先行研究で報告されているsplit-belt条件での即時的な適応がラットの後肢2足歩行においても観察された。後肢の関節仰角について特異値分解による運動学シナジー解析の結果、脚軸の回転運動に対応する第一時間協調においては、split-belt条件におけるベルト速度の速い側と遅い側とでそれらのピークタイミングを変化させ、脚軸の伸縮運動に対応する第二時間協調や空間協調については、ベルト速度の速い側の肢に特徴的な変化が観察された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2025-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究領域課題番号】20KK0226 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

歩行 / 肢間協調 / 運動学シナジー / 左右分離型ベルトトレッドミル / マウス / ラット / 小脳 / 神経筋骨格モデル / 脊髄 / 中枢パターン生成器

【研究成果の概要】

本研究は、Drexel大学との国際共同研究として、歩行運動における肢運動の協調とその適応的制御に関わる脊髄小脳ループの働きについて、ラット及びマウスを対象に、運動学的解析、電気生理学的解析、光遺伝学を適用した小脳プルキンエ細胞におけるシナプス可塑性の発現阻害操作などの実験研究と、神経筋骨格モデルを用いた動力学シミュレーションによる構成論的研究を組み合わせて解明することを目的としている。
ラット用左右分離型ベルトトレッドミルを用いて、ラットの後肢2足歩行時に、左右のベルト速度を同一にしたtied-belt条件から左右で異なるベルト速度のsplit-belt条件へ移行した際の運動学的特徴について3次元モーションキャプチャシステムを用いて解析した。それらの結果として、ヒト及びネコなどを用いた先行研究で報告されているsplit-belt条件での即時的な適応がラットの後肢2足歩行においても観察された。後肢の関節仰角について特異値分解による運動学シナジー解析の結果、脚軸の回転運動に対応する第一時間協調においては、split-belt条件におけるベルト速度の速い側と遅い側とでそれらのピークタイミングを変化させ、脚軸の伸縮運動に対応する第二時間協調や空間協調については、ベルト速度の速い側の肢に特徴的な変化が観察された。
新たに開発したマウス用の左右分離型ベルトトレッドミルを用いて、マウスの4足歩行時に左右のベルト速度を同一にしたtied-belt条件と左右で異なるベルト速度のsplit-belt条件での肢運動の歩容解析を深層学習技術を適用して行った。その結果、マウスの4足歩行時において、tied-belt条件からsplit-belt条件へ移行した際の運動学的特徴は前肢と後肢とでは質的に大きく異なり、特に、左右の前肢間における時間的協調について適応・学習の動態が明らかにされた。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

【研究期間】2020-10-27 - 2023-03-31

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)

【研究領域課題番号】19K07971 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mGluR5 / 代謝型グルタミン酸受容体 / 小脳 / mGluR1 / シナプス形成 / 瞬目反射条件付け学習 / GRM5 / トランスジェニックマウス / レスキュー / 神経変性 / シグナル伝達 / cerebellum / transgenic / mouse / L7 / neurodegeneration / 遺伝子操作マウス / 神経疾患 / グルタミン酸受容体

【研究成果の概要】

代謝型グルタミン酸受容体mGluRはGタンパク質共役型受容体であり、グループIに属するmGluR1とmGluR5はGqを介してシグナル伝達を行う。mGluR1は主に成体マウスの海馬歯状回、視床、小脳皮質で、mGluR5は大脳皮質、線状体、海馬CA1-CA3領域で多く発現しており、相互排他的な発現をしている。小脳ではmGluR5 の発現量が発達期から成熟期へ向けて減少し、それとは対照的にmGluR1の発現量は発達期から成熟期へ向けて増加していく。脊髄小脳変性症のモデルマウスでは、成体の小脳プルキンエ細胞において、mGluR1の発現量が減少するとともに、mGluR5の発現量が増加していることが報告されており、mGluR1やmGluR5が様々な精神疾患や神経変性疾患と関連していることも数多く報告されている。しかしながら、これら2つのmGluRの機能的差異と疾患との関係については明らかとなっていない。
本研究では、小脳プルキンエ細胞特異的にmGluR5を発現するようなマウスを作製し、このマウスをmGluR1ノックアウトマウス(mGluR1 KO)と掛け合わせた。mGluR1 KOマウスでは、シナプス形成の異常、小脳運動失調、瞬目反射条件付け学習の異常などが見られるが、mGluR5トランスジーンによりこれらの表現型すべてが回復することがわかり、小脳プルキンエ細胞ではmGluR5がmGluR1の機能を代替できることがわかった。しかしながら、mGluR5をmGluR1のかわりに発現するマウスでは、mGluRの足場タンパク質であるHomerとの結合量が少ないことが観察され、シグナル伝達効率に違いがあることが示唆された。また、これらのマウスでは加齢と共に体重減少も観察されるため、神経変性疾患で共通して見られる神経機能障害などの病態・病因の解明につながると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究領域課題番号】18H04012 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シナプス刈り込み / 生後発達 / 小脳 / プルキンエ細胞 / 登上線維 / エピジェネティクス / 遺伝子発現 / マウス

【研究成果の概要】

生後発達期の神経系におけるシナプス刈り込みは、動物が環境に適応するために神経回路を最適化する仕組みと考えられる。シナプス刈り込みには神経の活動が必須と考えられるが、神経の活動がどのような遺伝子発現を経てシナプス刈り込みを引き起こし、永続的な神経回路の変化として固定化されるのかはよくわかっていなかった。本研究では、マウスの小脳でみられるシナプス刈り込みをモデルとして、その仕組みを追及し、これに関わるエピジェネテイック因子や転写因子を同定した。

【研究の社会的意義】

シナプス刈り込みは、大脳皮質を含めた生後発達期の神経系で普遍的にみられる現象であり、正常な脳機能の発達に必須である。したがって、そのメカニズムの解明は、脳機能の発達の仕組みを理解するうえで極めて重要である。さらに、生後発達期のシナプス刈り込みの障害が自閉スペクトラム症の、また、思春期における過剰なシナプス刈り込みが統合失調症の発症に関連すると広く考えられており、これらの病態解明や治療法開発の点からも極めて重要である。シナプス刈り込みに関わることが知られている因子の中に精神神経疾患の関連遺伝子が含まれていることからも、その重要性が示唆される。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】44,720千円 (直接経費: 34,400千円、間接経費: 10,320千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】15K06701 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mTOR / トランスジェニックマウス / 小脳 / 遺伝子操作マウス / 小脳プルキンエ細胞 / マウス

【研究成果の概要】

小脳プルキンエ細胞におけるmTORシグナルの役割を明らかにするために、プルキンエ細胞特異的に活性化型mTORを発現するトランスジェニックマウスの作製・解析を行った。このマウスでは、プルキンエ細胞の細胞体および樹状突起が顕著に肥大化しており、離乳期を過ぎるとプルキンエ細胞のアポトーシスによる細胞死が観察された。プルキンエ細胞の変性に伴い、このマウスは運動失調を呈するようになったが、自閉症様の社会行動異常は観察されなかった。これらの結果より、小脳プルキンエ細胞においてmTORシグナルは細胞の生存およびサイズを制御していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】23240053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

グルタミン酸受容体 / エンドサイトーシス / 小脳 / シナプス可塑性 / プルキンエ細胞 / LTD / AMPA受容体 / マウス / シナプス形成 / 可塑性 / ニューロン / シナプス / 神経回路 / 海馬

【研究成果の概要】

シナプス伝達の長期抑圧（LTD）現象は記憶・学習の基礎過程であり、シナプス後膜におけるAMPA受容体の減少によって起きる。LTDは、1）AMPA受容体を足場分子から外す、2）AMPA受容体をエンドサイトーシスする、の2つの過程からなる。これまで後者の過程を担う機構はよく分かっていなかった。また小脳LTDになぜデルタ2型グルタミン酸受容体（GluD2）が必要なのかも謎であった。今回の研究により、GluD2はAMPA受容体の足場タンパク質からの外れやすさを調節することが判明した。また神経活動に応じてエンドサイトーシスに必要な分子AP-2が集積しAMPA受容体と結合することが分かった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】49,270千円 (直接経費: 37,900千円、間接経費: 11,370千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】13878165 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カルシウムチャネル / マウス / 細胞特異的ノックアウト / Cre-loxPシステム / 小脳 / プルキンエ細胞 / カルシウムチャンネル / Cre-1oxpシステム

【研究成果の概要】

本研究では、低閾値型カルシウムチャネルα1Gの小脳機能における役割を明らかにするため、α1G遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの作製を目的としている。昨年度、相同組み換えを生じた2種のES細胞クローンを用いて、キメラマウスの作製を行ったが、どのクローン由来のキメラマウスも生殖系列へのES細胞伝達を示さなかった。今年度は、昨年作製したターゲッティングベクターの相同組み換え領域を2kb延長して、再度ES細胞で相同組み換え体をクローニングした。その結果、おおよそ1%の確率で相同組み替えを生じたES細胞がクローニングできた。クローニングしたES細胞を用いて、マウス胚盤胞へのインジェクションを行ったところ、現在、ES細胞の寄与率の高いキメラマウスが誕生している。今後はこのキメラマウスを野生型マウスと交配してヘテロマウスを作製する予定である。さらに、小脳プルキンエ細胞特異的にα1G遺伝子を欠損させるため、プルキンエ細胞特異的にCre組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウスのベクターの作製も行った。今後は、このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作出し、上記のヘテロマウスと交配させる予定である。さらにα1Gサブユニット特異的な力価の高い抗体が存在しないため、α1G細胞内ループ領域を抗原タンパクとして大腸菌で合成し、ウサギを用いてポリクローナル抗体の作製を行った。作製し精製した抗体は、Western blot法により小脳抽出物中のα1Gサブユニットだと考えられる260kDaのバンドを特異的に認識した。今後は、ノックアウトマウスの解析に有効に使いたいと考えている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】体育学

【研究領域課題番号】12780018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小脳 / 代謝型グルタミン酸受容体 / 自律神経系 / マウス / 歩行 / 運動学習

【研究成果の概要】

自転車の乗り方や水泳の動作といった運動スキルの記憶は、ニューロンからニューロンへの情報伝達の場であるシナプスの可塑性を基礎過程としていると考えられている。現在までに、中枢神経系において運動スキルの記憶に重要な役割を果たしている場所としては小脳があり、実際に歩行の適応制御や前庭動眼反射の適応制御に小脳長期抑圧が重要な役割を果たしていることが証明されている。ところで、小脳は歩行や眼球運動などの体性運動の制御のみならず、心臓・血管系をはじめとする自律神経系の制御にも関与している。以前の研究は、ウサギまたはラットを対象に条件刺激として音刺激、無条件刺激として耳あるいは尾への電気刺激の呈示を組み合わせ、数秒間の音刺激呈示中に漸進的に心拍数が低下する徐脈を観察し、この条件付け徐脈反応が小脳虫部の破壊により減弱されることを報告している。本研究では長期抑圧の発現にも深く関わる代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)が条件付け徐脈の発現においてどのように機能しているのか明らかにすることを目的とした。逆進性遺伝学的手法によりmGluR1を欠損させたmGluR1ノックアウトマウス、小脳プルキンエ細胞だけにmGluR1が発現し、他の脳組織には発現していないmGluR1レスキューマウスを用いて、その条件付け徐脈について詳細に調べた。条件刺激(音刺激)と無条件刺激(尾部への電気刺激)を組み合わせた恐怖条件付けパラダイムにより、すべてのマウスにおいて条件付け徐脈の獲得・保持・消去が同様に観察されたが、音刺激呈示中の徐脈において、mGluR1ノックアウトマウスに顕著な特徴が観察された。mGluR1ノックアウトマウスは野生型マウスに比べて著しく大きな徐脈を示した。一方、小脳プルキンエ細胞にのみmGluR1が発現しているmGluR1レスキューマウスは野生型マウスと同様のレベルの徐脈を示した。これらの結果より、小脳プルキンエ細胞におけるmGluR1は、小脳が介在した自律神経系の制御に関与し、条件付け徐脈において、条件刺激に対する心拍応答(徐脈)の大きさの調節に関与していることが結論される。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】11878162 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マウス / 小脳 / プルキンエ細胞 / (単離)培養 / 無血清培地 / 形態発達 / シナプス発達 / パッチクランプ法 / 電気生理学的発達

【研究成果の概要】

本研究では培養系において単離小脳プルキンエ細胞に対するシナプス形成過程のリアルタイム分析を目指している。第1段階として、マウス・プルキンエ細胞の単離培養系の開発を行い、さらに培養プルキンエ細胞の発達過程を分析した。小脳ニューロンに最適化した無血清培地(Furuya et al.,1998)を用い、さらに播種密度などの諸条件を系統的に検討した結果、従来難しかったマウス胎児由来単離小脳プルキンエ細胞の長期(1ヶ月以上)培養が可能となった。また、この方法により培養したプルキンエ細胞では樹状突起形態や電気的興奮特性の発達が生体内での生後発達と良く似た時間推移で進行し、所期の実験遂行に適当であることが分かった。第2段階として、上記の培養系に下オリーブ核ニューロンをの共培養する技術を開発した。2〜3日前に準備しておいた小脳ニューロン培養系の上に妊娠16日齢マウス胎児由来の下オリーブ核スライスを貼付することにより、登上線維を数百ミクロンにわたって出芽・伸展させることに成功した。また共培養開始直前にgene gunを用いて蛍光色素DiIを付着させた金属微粒子を下オリーブ・スライスに打ち込む技術も開発した。この技術により、生きたままの状態で登上線維を効率良く標識できるようになった。さらにDiI標識像をレーザー共焦点顕微鏡で5〜10分毎に観察することにより、登上線維の伸展の様子を24時間以上にわたりリアルタイムで観察することに成功した。現在、第3段階として、GFP遺伝子を導入し自家蛍光を発するようにしたプルキンエ細胞を単離培養系の材料として用い、DiI標識登上線維のGFP標識プルキンエ細胞に対する神経支配過程のリアルタイム分析を進めている。なお、培養法に関する成果はJournal of Neuroscience Methods (Tabata et al.,104:45-53,2000)に発表した。また、培養法の応用に関する論文をProc.Natl.Acad.Sci.USA.
(Furuya et al.,97:11528-11533,2000)に発表し、Journal of Neuroscienceにも投稿中である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】09878195 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マウス / 小脳 / 脳由来神経栄養因子(BDNF) / 顆粒細胞 / 登上線維 / 平行線維 / パッチクランプ / AMPA受容体

【研究成果の概要】

小脳顆粒細胞において脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現が選択的に欠如しているStargazer mouseと野性型マウスを比較することにより、小脳顆粒細胞から分泌されるBDNFの、(1)登上線維-プルキンエ細胞シナプス、(2)平行線維-プルキンエ細胞シナプス、(3)苔状線維-顆粒細胞シナプス、に及ぼす作用を電気生理学的に調べた。
(1)登上線維応答の生後発達の解析:小脳スライスを作製し、プルキンエ細胞をからwhole-cell patch-clampを行なった。内顆粒層で登上線維を電気刺激して興奮生シナプス後電流(EPSC)を誘発した。Stargazer mouseでは、野性型マウスに比較して、各日齢において、登上線維EPSCの振幅が有意に減少していた。しかし、生後4週以降の成熟したStargazer mouseにおいて、プルキンエ細胞の登上線維による多重支配の残存はみられなかった。
(2)平行線維シナプス伝達の解析:(1)と同様に、小脳スライスプルキンエ細胞からwhole-cell patch-clamp記録をし、分子層で平行線維を刺激してEPSCを誘発した。登上線維EPSCと同様に、各日齢において、平行線維EPSCの振幅が有意に減少していた。
(3)苔状線維-顆粒細胞間の興奮性シナプス伝達の解析:小脳スライス顆粒細胞からwhole-cell patch-clamp記録を行い、顆粒細胞周囲の苔状線維を刺激してEPSCを誘発した。野性型マウスでは、顆粒細胞EPSCに早いkineticsを持つAMPA受容体成分と遅いkineticsを持つNMDA受容体成分がみられたが、Stargazer mouseではAMPA受容体成分のみが有意に減少しており、NMDA受容体成分のみが記録される細胞も数多くみられた。
プルキンエ細胞における登上線維EPSCおよび平行線維EPSCはAMPA受容体成分のみによることが明らかにされているので、以上の結果は、Stargazer mouseにおける小脳の異常は興奮性シナプスにおけるAMPA受容体の機能低下によると結論された。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997

【配分額】1,800千円 (直接経費: 1,800千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】08458264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マウス / 小脳 / プルキンエ細胞 / 登上線維シナプス / パッチクランプ / 生後発達 / 多重支配 / ノックアウトマウス

【研究成果の概要】

(1)正常動物登上線維応答の性質と生後発達: マウスの登上線維応答の性質を日齢をおって電気生理学的に調べた。生後1週から2週にかけて、登上線維による多重支配を受けるプルキンエ細胞の比率が大きく減少した。また、生後1週目の登上線維応答は、EPSCの立上り時間が遅いこと、登上線維2発刺激に対するpaired-pulse depressionの程度が強いことなど、成熟型の登上線維応答とは性質が異なっていた。また、ラットを用いてpaired-pulse depressionの性質を調べ、伝達物質放出減少がその主因であることを明らかにした。
(2)mGluR1、Gαq、PLCβ4ノックアウトマウスの解析: プルキンエ細胞では、代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)、3量体GタンパクGq、phospholipaseCβ4(PLCβ4)を介してprotein kinase Cγ(PKCγ)の活性化が起こると考えられる。mGluR1、Gqのαサブユニット(Gαq)、PLCβ4のノックアウトマウスを用いて登上線維シナプス発達に及ぼすこれらの関与を調べた。いずれも、生後3週目以降に約1/3のプルキンエ細胞が複数の登上線維による多重支配を受けており、この発達の異常は、以前報告したPKCγノックアウトマウスと同様であった。これらより、mGluR1-Gαq-PLCβ4-PKCγを介するシグナル伝達系が過剰な登上線維排除に必須であると考えられた。
(3)GluRδ2ノックアウトマウスの解析: プルキンエ細胞に特異的なδ2型グルタミン酸受容体(GluRδ2)ノックアウトマウスでは、小脳平行線維-プルキンエ細胞シナプスの形成が正常の約半分に低下していた。また、登上線維シナプスの電気生理学的性質を調べた結果、登上線維がプルキンエ細胞の遠位樹状突起に、過剰な異所性シナプスを形成していることがわかった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】8,700千円 (直接経費: 8,700千円)