Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

ニューロン / inka2 / Pak4 / アクチンフィラメント / 樹状突起スパイン / アクチン / 接着班 / 細胞移動 / PP2A / スパイン / 大脳皮質 / アクチン骨格 / fmr1

inka2は哺乳類胎生期神経系において延髄や脊髄の腹側部脳室周囲のオリゴデンドロサイト前駆細胞や成体の大脳皮質や海馬などの前脳領域のニューロンに強く発現する。培養細胞にinka2を強制発現させると、アクチン線維の細胞内配置の異常が起こり、細胞形態が球状に変化し細胞接着の阻害や過剰な数のフィロポディアが形成される。我々はこれまでにNIH3T3のスクラッチアッセイによりinka2が接着斑(focal adhesion)の形成を調節し細胞移動能を制御することを明らかとしたが、その分子機構は不明である。セリン・スレオニンキナーゼであるPak4は、RhoGTPaseのエフェクター分子としてアクチン重合を制御する。今回、我々は脳組織及び培養細胞を用いた共免疫沈降や、inka2およびPak4組換えタンパク質を用いたキナーゼアッセイにより、Inka2-iBoxがPak4触媒ドメインに直接結合し、アクチン重合を抑制することを見出した。培養細胞に発現させたInka2はアクチンの脱重合を促進しPak4 活性を介した細胞突起の形成を抑制した。さらにInka2遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを作製した。β-ガラクトシダーゼレポーターにより、Inka2が大脳皮質ニューロンに強く発現していることが示された。Inka2-/-マウスの皮質錐体ニューロンでは、樹状突起スパインの密度が低下し、樹状突起の形態に異常が見られた。さらにInka2-/-マウスの大脳皮質ニューロンではPak4シグナルカスケードの下流分子LIMKとcofilinの顕著なリン酸化亢進が認められた。これらの結果から、Inka2がニューロンにおける内在性Pak4阻害剤として機能すること、樹状突起スパインの形成に必要なアクチンの再編成の重要なメディエーターであることが明らかとなった。

樹状突起棘 / 細胞骨格 / ドレブリン / アクチン / 発達 / 老化 / シナプス成熟 / 神経発達 / 神経培養 / 神経細胞 / 樹状突起 / スパイン / シナプス / グルタミン酸受容体 / 海馬 / アクチンフィラメント / 遺伝子導入

(A)スパイン細胞骨格蛋白群の解析
ドレブリン特異抗体を固定化したビーズを用いて樹状突起スパインの細胞骨格蛋白群を調整すると、ドレブリンの他、アクチン、3種のミオシンとゲルゾリンがその中に含まれるていたが、さらに多くの未同定蛋白が含まれていることが蛋白電気泳動法により確認された。そこでこの標本を免疫源としてモノクローナル抗体を作製したところ、脳に特異的なミオシン用蛋白を認識する抗体(文献13)、神経細胞が分泌する細胞外基質を特異的に認識する抗体、カルモデュリンカイネースを認識する抗体がとれた(口頭発表11、13)。
(B)発達・老化に伴うスパイン細胞骨格系の変化
発達過程のラット大脳におけるドレブリンのアイソフォーム変換と樹状突起スパインヘの局在化を、経時的に調べた。(1)発達初期ではドレブリンは細胞体膜直下及び突起に連続性に分布しているが、発生が進むに従い、ドレブリンはクラスタリングすることがわかった。(2)次に、発達過程のラット大脳におけるドレブリンのアイソフォーム変換についてウェスタンブロッティングにより調べた。その結果、ドレブリンAの発現増加はドレブリンのクラスタリング時期と一致する事がわかった。(3)ドレブリンのクラスタリングはNMDA受容体活性に依存性であることがわかった(口頭発表4,7)。(4)また、このドレブリンAの発現増加に並行して、アクチン非結合型のドレブリンが激減することが観察された(口頭発表22)。従って、ドレブリンの樹状突起スパインヘの局在化は、RNAプロセッシングの変化により、ドレブリンのアイソフォームが成熟型となり、アクチンに対する結合活性が変化することにより引き起こされると推定された。(5)GFP融合ドレブリンを初代培養神経細胞に発現させたところ、スパインの長さが長くなることを発見した(文献9)。

【研究分担者】
斉藤佳子	群馬大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
林謙介	群馬大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)
関野祐子	群馬大学	医学部	講師	(Kakenデータベース)