Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

高分子ミセル / 遺伝子デリバリー / ブロック共重合体 / ナノカプセル / DNA / 生体適合性 / ポリエチレングリコール

本研究は、遺伝子ベクターとして設計されたブロック共重合体であるポリエチレングリコールーポリリシン(PEG-PLL)とプラスミドDNA(pDNA)の複合体形成に関する特性解析を目的とする。初年度に、AFMによる高次構造解析、滴定型等温熱分析装置(ITC)によるPEG-PLLのpDNAへの結合挙動解析の予備検討を行った。本年度はITCによる予備検討結果を詳細に解析するために、single set of identical sites modelを組み合わせた新規フィッティング法の開発を継続した。
低分子凝縮剤によるDNA凝縮と、PEG-PLLによるDNA凝縮では類似の滴定曲線が得られ、いずれも2成分に分離可能である。各々の熱力学的パラメータを導出する際に、既知のtwo-site bindingモデルによるフィッティングを行うと、第1結合過程と第2結合過程のカチオン種の結合では必ず前者が強いという条件下で解析が行われるが、本研究で開発したフィッティング法ではこの条件に制約されることなく結合挙動を解析できる点が優れている。カチオン性高分子によるDNA凝縮では、重合度の減少と塩濃度の増加に伴いカチオンのDNAへの結合力が減少し、結合に伴うエンタルピー変化は小さく、自由エネルギーとエントロピーの変化は同程度で大きいことから、自由エネルギー減少に伴って本来系の外に発熱するはずの熱が系の内部でのエントロピー増加に用いられることが明らかとなった。DNAの構造変化のみに対応する熱力学変数を、DNA凝縮を伴う結合過程における熱力学変数から凝縮を伴わない初期の結合過程における変数の差によって表されることを示し、この結果からもエントロピー効果に関して同様の結論を得た。PEG-PLLとPLLホモポリマーの比較の結果、後者で顕著な二次凝集による熱量変化に関する知見を得ることも出来た。

遺伝子デリバリー / 温度応答性高分子 / DNA / 高分子キャリアー

温度に応答して相転移を起こすN-isopropylacrylamide(IPAAm)とカチオン性の3級アミノ基を有する2-(dimethylamino)ethyl methacrylate(DMAEMA)、さらに疎水的な分子であるbutylmethacrylate(BMA)の3つのユニットからなる直鎖状のrandom copolymer(IP-20D-10B、合成時のDMAEMAおよびBMAのモル比がそれぞれ20,10%)について、COS-1細胞に対する遺伝子導入効率を動力学的に解析した。遺伝子にはβ-galactosidaseをコードしたplasmid DNAを用い、これを96well plateの1wellに対し0.1μg加えた。既往研究と比較して、この濃度は2分の1から10分の1という低い条件である。この低dose条件でも、IP-20D-10BはCOS-1細胞に効率的に遺伝子を導入することができる。
IP-20D-10Bとplasmid DNAの比を変化させて遺伝子導入効率と細胞毒性へ与える影響を検討した。高分子キャリアーの比率を増加させるに従い遺伝子導入効率は増大し、N/P比(高分子のアミノ基とDNAのリン酸基のモル比)10/1で飽和に達した。しかし、細胞毒性も徐々に増大し、N/P=10では10%と顕著になった。一方、N/P=4/1では細胞毒性が約3%と極めて低く、また遺伝子導入効率も飽和値の3分の2という高い活性を示すことを見出した。N/P=4/1の遺伝子導入効率は、高活性な脂質系遺伝子導入試薬として知られるDOTAPの5倍以上に上り、またlipofectAMINE plusに匹敵した。
続いて、遺伝子導入操作後の細胞に温度変化を与え、この外部刺激により導入した遺伝子の発現効率を制御することを試みた。遺伝子導入操作後、一時的に細胞培養温度を37℃から27℃または20℃へと低下させ3時間培養すると、37℃で継続的に培養を行った場合と比べて導入遺伝子の発現が増大した。特に20℃へと低下させた場合では約2倍の発現効率の上昇が観測され、この活性の増大は統計学的(P<0.05)にも有意であることを示した。

高分子ミセル / 遺伝子デリバリー / ブロック共重合体 / ナノカプセル / DNA / 生体適合性 / ポリエチレングリコール

本研究では、内核に遺伝子DNAを保持し、表層部に標的細胞による認識と取込みを促進させるパイロット分子を結合させた生体適合型高分子ミセルを創製し、新規遺伝子ベクターとしての有用性を検証した。高分子ミセルの構築には、ポリアニオンである遺伝子(プラスミドDNA)の性質に着目し、ポリカチオン連鎖を持つマルチ機能化ブロック共重合体との静電相互作用による会合体形成を活用した。すなわち親水性で生体適合性に優れ、α-末端に各種パイロット分子を結合可能なポリエチレングリコール連鎖とDNAとの静電相互作用が可能なポリアミン連鎖が連結したマルチ機能化ブロック共重合体とプラスミドDNA間の自己会合プロセスに基づき高分子ミセルを調製し、その表層にパイロット分子を連結する方法論を確立した。
本研究で創製した高分子ミセルは、ウイルスと同等のサイズで、遺伝子を保持する内核が親水性外殻で覆われる明確な二層構造をとる為、(1)溶解性や安定性等の製剤学的特性の向上、(2)体内での非特異的異物認識を免れ半減期が延長、(3)血管壁透過性を含めた組織浸透性の向上、(4)パイロット分子を介する標的細胞への取込み増大など、in vivo遺伝子ベクターが具備すべき基本的用件を充分に満足する。また内包遺伝子の大きさを任意に選択でき、細胞内環境応答機能団の組込みにより遺伝子の細胞内移行も制御できるなど、ウイルスを凌駕する特色を備えている。この高分子ミセルは培養細胞における優れた遺伝子発現効率を有すると共に、細胞内還元環境に応答して内包遺伝子を放出する高いインテリジェント機能を発現する。またマウス血中投与により、肝臓に一様に遺伝子発現を導く事にも成功した。本研究で創製した高分子ミセル型遺伝子ベクターは従来型ベクターの欠点を克服しており、普遍的な人工ウイルス型ベクターとして遺伝子治療分野の進展に多大な貢献をもたらすと確信される。

【研究分担者】
山崎裕一	東京大学	大学院・工学系研究科	講師	(Kakenデータベース)
斯波真理子	国立循環器病センター研究所	室長	(Kakenデータベース)
原田敦史	東京大学	大学院・工学研究科	助手	(Kakenデータベース)