効率的遺伝子組み換えミニブタ作出デバイスの開発
【研究分野】医用生体工学・生体材料学
【研究キーワード】
遺伝子組み換ええミニブタ / 共焦点レーザ顕微鏡 / 遺伝子導入 / Micro porous glass / micro manipulator / Enhanced green fluorescent protein / 遺伝子組みえ替えミニブタ / 三次元視硬性内視鏡 / ミニブタ卵胞卵 / レーザ共焦点顕微鏡 / 水浸型対物レンズ / 遺伝子組み換えミニブタ / 培養卵保持MPGマイクロポケット / 低侵襲採卵 / GFP(green fluorescent protein)
【研究成果の概要】
トランスジェニック(Tg)ミニブタ作製技術は細胞・組織・臓器移植のための異種移植ドナー作出等、様々な分野に極めて大きなインパクトをもたらす。しかし、Tgブタ作製効率は大変低く、多大の時間、労力と経費を要する。食肉センター由来の卵巣資源を用いた体外受精により、遺伝子導入に必要不可欠な前核期受精卵を安定供給でき、Tg胚をあらかじめ移植前に選抜し、母体へ戻すことができれば効率的である。本研究では、Tgブタ作製高効率化を目的として、まず、ブタ体外成熟・体外受精卵作出における卵巣採取個体の性成熟の影響と体外受精前核への遺伝子注入時期検討し、次いで、移植前選抜レポーターとしてのEnhanced green fluorescent protein(EGFP)の有用性をコンストラクトの異なる3種のEGFP遺伝子を前核期体外受精卵へ顕微注入、その後の体外発生およびEGFP発現状況に及ぼす影響を調べた。また培養システムとしてMPG(micro porous glass)のマイクロポケットに循環する流れに乗せて固定しレーザ共焦点顕微鏡下で培養し、培養過程で卵の2次元画像や、3次元形状を連続的に観察可能とした。さらに、体外受精卵前核への遺伝子注入操作における装置の自動化についても検討した。その結果、1)開発した乱培養装置にて培養が可能であること、2)性成熟雌ブタ由来卵子を用いることにより効率的な体外受精卵生産ができること、3)体外受精後12時間での前核形成初期においても遺伝子注入操作が可能であること、4)EGFP遺伝子の導入効率はプロモーターの種類と注入DNAの断片長に影響されこと、5)胚選抜のマーカー遺伝子としてのEGFP遺伝子の利用は、ブタ胚では4細胞期胚や胚盤胞が適していること、および6)顕微鏡下における遺伝子注入操作装置の自動化はTgブタ胚作製の高度化に有効であることが判明した。
【研究代表者】