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過酸化水素 / イメージング / リン光色素 / グルコース / カタラーゼ / グルコースオキシダーゼ

本申請研究では、リン光性色素を利用した細胞外および細胞内の過酸化水素プローブを開発し、細胞実験への利用を目指した。細胞外過酸化水素プローブとして、カタラーゼを固定化した白金ポルフィリン含有ポリスチレンビーズを開発し、培地中の過酸化水素濃度変化をビーズからの発光量で観察できた。またグルコースオキシダーゼを固定化することで、グルコース濃度も同様に観察できた。細胞内過酸化水素プローブとして、白金ポルフィリン修飾カタラーゼを調製し、過酸化水素濃度応答性を確認した。

本申請研究では、リン光性色素の可逆的な酸素応答性を利用して、酵素反応による酸素の増減を介した新規小分子プローブの開発に取り組んだ。カタラーゼを利用した過酸化水素プローブでは、従来の蛍光性色素プローブでは困難であった過酸化水素の経時的な増減が観察可能となる。さらに、本研究で開発したプローブ技術は、グルコースオキシダーゼを利用することでグルコースプローブとして機能することが明らかとなり、使用する酵素によって様々な低分子プローブとしての応用が示された。

過酸化水素 / ルミノ-ル / グルコ-ス / 電気化学発光 / グルコ-スオキシダ-ゼ / 溶存酸素 / グルコ-スセンサ

1.連続供給される過酸化水素ールミノ-ル混合液をポテンシオスタットによってー定電位に保たれた透明電極と接触させ、生じる電気化学発光の強度を光電子増培管で測定する装置を作製し、該装置の過酸化水素定量性を調べた。その結果、該装置の過酸化水素検出限界濃度は0.1μM程度である。したがって、本装置による過酸化水素定量法の感度は、従来の化学発光法と同程度である。
2.該装置による過酸化水素定量を安定して操作するための、透明電極至適電位は0.40V vs.SCEであることが判明した。また過酸化水素濃度が0の場合でも、溶存酸素とルミノ-ルの反応によって発光する(バックグラウンド発光)。安定性の良い過酸化水素定量を行うためには、このバックグラウンド発光を排除することが望ましいと考え、オンラインデガッサ-で、試験液中の溶存酸素を除去し、バックグラウンド発光の排除を試みた。しかし、この装置でパックグラウンド発光を十分に排除することは不可能であった。むしろ、試験液の溶存酸素濃度を高く保ち、バックグラウンド発光強度を飽和させ、変動を小さくさせる方が、安定した過酸化水素濃度測定に有利であることが判明した。
3.該装置を、グルコ-スを過酸化水素に変換する固定化酵素カラムと連結し、グルコ-スの定量装置を作製した。その結果、この定量装置によって測定可能なグルコ-ス濃度範囲は0.1〜1.1mg/dlである。この濃度範囲は、汗のグルコ-ス濃度範囲を包含している。したがって、このグルコ-ス定量装置で、汗のグルコ-ス濃度を測定し、その値から間接的に血糖値を推算することにより、血糖値の非侵襲的測定が可能になることが示唆された。