【研究領域課題番号】21K19201 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA-タンパク質複合体 / クライオ電顕 / 構造解析 / RNA / タンパク質

【研究成果の概要】

ＲＮＡは多岐にわたる重要な役割を担う生体高分子化合物である。多くの場合、ＲＮＡはパートナー蛋白質と複合体を形成することにより複雑な生体反応を実現している。そのため、ＲＮＡの機能を理解するにはＲＮＡと蛋白質の複合体の構造を原子レベルで明らかにすることが鍵となる。本研究では、ＲＮＡ配列をリボソームＲＮＡに挿入して表面に露出させ、ここに結合するタンパク質を結合させることにより、「ＲＮＡ-蛋白質複合体」をリボソーム表面に形成させ、これを丸ごと構造解析する技術を開発することにより、ＲＮＡ科学の研究領域を加速することをめざす。２０２１年度は、立体構造に基づきリボソーム上のＲＮＡの挿入部位を検討し、５箇所のＲＮＡループ領域を選出した。さらに、これらの部位に目的のＲＮＡ配列を挿入した変異リボソームを作成した。リボソームＲＮＡ遺伝子の欠損大腸菌に任意の配列のリボソーム遺伝子を乗せたプラスミドを導入し、これを培養することで変異リボソームを調製した。いずれの設計においても良好に大腸菌は生育し、設計に問題がなかったことが確認できた。また、挿入したＲＮＡに結合するタンパク質を調製した。大腸菌発現系を用いて、３種類のタンパク質を可溶性分子として大量発現させた。２つのタンパク質については良好に発現したが、一つについては発現量が少なく、また、大腸菌内のＲＮＡと強く結合しており、十分な量の試料を得ることができなかった。今後、試料調製法を検討する必要がある。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2021-07-09 - 2023-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究領域課題番号】18H03980 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / タンパク質 / ＲＮＡ / 複合体 / 分子機構 / RNA / X線結晶解析 / 修飾酵素 / プロセシング / 結晶構造解析 / 蛋白質 / 構造 / 機能 / X線 / 構造解析 / 機能解析 / RNA－蛋白質複合体 / X線構造解析 / ノンコーディング / 鋳型非依存 / 機能制御

【研究成果の概要】

本研究では、高次生命現象を支配する鋳型非依存的ＲＮＡ合成酵素のうち、let7 miRNAの発現を制御するTUT4/7によるポリU付加の分子機構をLin28と相互作用するTUT4/7の領域の構造解析、生化学的解析より明らかにした。また、U6 snRNAの成熟化に関わるTUT1によるポリU付加の分子機構をTUT1とU6 snRNAの複合体構造解析、生化学的解析より明らかにした。RNAのポリA鎖にA/Gミックス鎖を付加するTENT4/Bの構造解析に成功し、ヌクレオチドの特異性に関する知見を得た。また、各種RNA修飾酵素、プロセス酵素の構造決定に成功し、それらの酵素の反応制御機構を明らかにした。

【研究の社会的意義】

本研究で明らかにしたTUT4/7によるpre-let7のLin28依存的ウリジル化の分子機構はがん抑制作用のあるlet7 miRNAの発現を制御する薬剤開発の基盤になり、また、U6 snRNAの成熟化に関わるTUT1によるウリジル化の分子機構はU6 snRNAの成熟化異常に起因する疾病に対する薬剤の開発の基盤になると期待できる。また、HBCなどのmRNAを安定化させるTENT4A/4Bの特異性の分子機構解明はウイルスの増殖に対する薬剤の開発などの基盤となると期待できる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】43,810千円 (直接経費: 33,700千円、間接経費: 10,110千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】15770064 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線構造解析 / RNA-蛋白質複合体 / ポリメラーゼ / 鋳型非依存性 / 反応機構 / RNA / 核酸合成 / tRNA / 修復 / 鋳型

【研究成果の概要】

tRNAの3'末端CCA配列(74-76の位置)は、tRNAの末端へのアミノ酸付加および蛋白質合成におけるリボゾームとの相互作用に必須である。CCA配列は、CTPおよびATPを基質として、CCA付加酵素と呼ばれる鋳型非依存性RNAポリメラーゼによって修復、あるいは新規合成される。CCA付加酵素が核酸の鋳型を用いずに定まった配列を定まったプライマーへ付加するメカニズムは未解決のままである。本研究において、我々は、Aquifex aeolicus由来の酵素の結晶構造を、末端のアデノシンが欠けているtRNAおよび付加されるATPアナログと結合した状態で決定した。この構造は世界で初めての鋳型非依存性RNA合成酵素の三者複合体の構造を決定したものである。酵素はtRNA分子のアクセプター・Tヘリックスを包み込むように結合している。触媒ポケットにおいて、ATPの塩基はそれに相補的なアミノ酸残基によって認識されており、またC75はATPに隣接しており、それらの塩基部分は互いにスタッキング相互作用をしている。tRNAのC74-C75を認識する相補的ポケットはヌクレオチドに対して蛋白質性の鋳型を形成しており、これは鋳型依存的ポリメラーゼによって用いられるヌクレオチドの鋳型を模倣している。我々の構造は、鋳型非依存性RNA合成酵素の分子的基盤を提示したのみではなく、核酸から蛋白質への機能移譲の進化的メカニズムを理解するうえで重要な知見を与えるものである。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)