【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】11308026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目標は筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造をまずは、既に薄いながらもX線レベルの三次元結晶が得られていたカルシウム結合状態(ElCa^<2+>)の結晶を用いて、原子分解能で決定し、さらに他の生理的状態に関しても結晶化を進めることであった。本研究は我々の期待を上回る速度で進行し、3つの状態について原子モデルを構築でき、さらに他の2つのカルシウム結合状態(E1ATPとE1Pのアナログ)についても結晶化に成功している。この結果、カルシウムと燐酸の離脱に伴う構造変化を明らかにすることが出来た。すなわち、カルシウムの離脱に伴い10本ある膜貫通ヘリックスのうち、6本が大きな再配置を起こし、カルシウム結合時には大きく離れていた三つの細胞質ドメインはコンパクトに集合することが判明した。膜貫通ヘリックスのうち2本は、膜に対し垂直方向の運動成分を持ち、カルシウムの離脱・結合に伴って、ピストンのように運動すること、すなわちP型イオンポンプは原子サイズの手押しポンプのような機構を持っていることが明らかとなった。その成果の一部は2000年6月と2002年8月にNatureに、2002年12月にPNASに発表することが出来た。
以上の成果は世界的注目を集め、NatureやNature Structure BiologyのNew ＆ Views、ScienceのEditor's choiceで詳しく紹介された他、世界標準の生化学、分子生物学の教科書に最近の大きな成果として紹介されている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】31,110千円 (直接経費: 30,600千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10044198 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 大量発現 / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目的はP型イオンポンプによる能動輸送のメカニズムを構造面から理解しようとするものであった。計画立案時には、結晶が小さく、電子顕微鏡による解析しか不可能であったが、X線結晶解析に適用しうる三次元結晶の作製に成功したため、将来の発展を考え、部位特異的変異体の構造解析のための準備に重点を置くことにした。そのため、アデノウイルスによる発現系を用いてカルシウムATPaseの大量生産に成功している、米国メリーランド大学イネシ教授との共同研究を中心に据えた。カルシウムATPaseは分子量11万の膜蛋白質であるため、同教授グループしか構造解析に必要な量の産生に成功しているグループはないからである。この目的のために、代表者が一度渡米、イネシ教授側が3度来日して、研究の打ち合わせを行った。特に問題となったのは、培養細胞からの抽出精製方法である。イネシ教授側の最初の来日時に、代表者が結晶化の為に改良してきた精製法を収得して貰い、培養細胞系に適用した。その結果、従来の色素カラムによる精製方法では、純度の点で不十分であることが判明したため、改良を検討している。また、カルシウム存在下の構造に関し高分解能でのX線結晶解析がほぼ終了したため、その結果をイネシ教授側が行ってきた、カルシウム結合に関与した部位特異的変異体を用いた実験結果の解釈に利用することが出来た。これらの実験は相補的であり、大変有意義な成果をもたらした。この結果は共同の論文として、現在投稿中である。また、この過程で、共同で総説を書くことが出来た(印刷中)。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】4,700千円 (直接経費: 4,700千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】04454618 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋小胞体 / カルシウム / ATPase / 三次元構造解析 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 低温電子顕微鏡法 / カルシウムATPase / 三次元構造 / 構造変化 / 蛋白質結晶 / 画像解析

【研究成果の概要】

本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包理電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標とした。まず、ATPとカルシウムがともに結合していない状態のチューブ状結晶から14A分解能で三次元構造を解析し、Natureに発表した。この結果、膜内構造は3つのセグメントからなるユニークなものであることが判り、アミノ酸配列から予想される二次構造ともかなりの対応がつけられた。さらに、加水分解されないATPのアナログであるクロミウムATPを結合させた状態の構造を、やはり14A分解能で解いた。両者のチューブ状結晶においてらせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していたポケットが埋まり、そのすぐ上の領域が蓋のように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bセグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側まで伝わることが確かめられた。高濃度のカルシウイオン存在下で生成する三次元微結晶に関しては、10Aを越える分解能で、膜に沿った方向の像を得た。以上の研究によって、次の段階である時間分解構造解析の基礎を作ることができた。
一方、チューブ状結晶の歪みを補正するための一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適用したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,700千円 (直接経費: 6,700千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】03680228 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

三次元構造解析 / 膜蛋白質 / カルシウムATPase / 筋小胞体 / 低温電子顕微鏡法 / 氷包埋法 / 蛋白質結晶

【研究成果の概要】

本研究では,筋小胞体のカルシウムポンプである,カルシウムATPaseの三次元構造を,自然な脂質二重膜に埋まったままの状態で,氷包埋低温電子顕微鏡法を用いて,14Å分解能で求めた。(現在は,結晶化条件の検討によって,11Å分解能の顕微鏡像も得られている。)三次元像は,チュ-ブ状結晶のらせん対称性を利用し,本研究で改良したプログラムを用いて得た。らせんのパラメ-タはチュ-ブごとに異っていたが,私が開発した手法により,系統的指数付けを行い,3種の独立した平均デ-タを得た。得られた構造は,分解能の違いによる差はあるが,基本的に同一であった。これは,高等動物の膜蛋白質の3次元構造としては,現在得られている最も詳細なものである。最大の成果は,この分子の膜内の構造が初めて明らかになり,一次構造との対応もある程度つけられたことである。上記の分解能では個々のαらせんは解像できないが,膜内は,細胞質側とつながった主要部の他に,2つの細い(1〜2本の膜貫通らせんから成ると考えられる)部分から成っていた。そのうちの一つは膜に対して著しく傾斜しており,主要部と小胞体内側で結びつけられていた。アミノ酸配列からは一本だけ異常に長い膜貫通らせんの存在が予想されており,このらせんと主要部との間にのみ,比較的長いペプチド鎖の存在が予想されていた。従って,得られた三次元構造は,構造予測のモデルと非常に良く一致するものであった。この長い傾いたらせんと機能の関係は現在のところ解っていない。
一方,プログラムの開発も続けられており,格子の歪みを補正する新しいプログラムの開発を行った。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1991

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】03558028 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

閃光光分解 / 氷包埋法 / 低温電子顕微鏡法 / caged物質 / 時間分解 / 三次元構造 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / 氷胞埋法 / 三次元構造解析 / 急速凍結法

【研究成果の概要】

本研究は、生体反応に伴う生体高分子の構造変化を分子レベルで可視化すべく、氷包埋低温電子顕微鏡法とcaged化合物の閃光光分解を組み合わせた、新しい技術を開発しようというものである。時間分解能を得るために、試料を閃光照射による反応開始から適当な時間で急速凍結し、ガラス状の氷に試料を包埋したまま、染色・固定無しに低温で観察する。そして、電子顕微鏡像から三次元構造を再構成する。この研究は代表者が英国で行った予備的研究に基づくものであり、閃光照射に伴う熱発生を如何にして抑えるかが、技術上最大の問題であった。Caged物質の閃光光分解は他の分野で既に使われているが、熱の問題は、電子顕微鏡法に応用する際、特に大きな問題となる。それは、試料が支持膜上の非常に薄い溶液(氷)の層であり、支持膜は光分解に使われる近紫外の光に対し不透明であるためである。本研究では、光源にネオディミウム・ヤグレーザ、caged物質としてcaged-ATPを用いた。パルス・レーザーは、単色の光源として優れているが、パルス幅が数ナノ秒と短く、支持膜からグリッドへの熱伝導が殆ど起こらないため、熱の問題は予想よりも遥かに深刻であった。しかし、支持膜に銀を採用することで入射光の大部分を反射し、入射光をグリッドと平行に近くなるまで低い角度で照射することによって、著しく低減できた。この結果、試料である膜蛋白結晶の規則構造を保ちつつ、10%以上の変換効率でcaged物質を閃光光分解することができた。本研究によって、生体反応を可視化する道が開けたといえよう。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1991 - 1992

【配分額】8,400千円 (直接経費: 8,400千円)