【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】05508004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

電子顕微鏡 / 蛋白質結晶 / 電子線回折 / 氷包埋法 / 構造解析 / 電子線損傷 / クライオトランスファー / 結晶解析 / 電子線回析 / 低電子線量法 / CCDカメラ / 電子線 / 三次元構造解析

【研究成果の概要】

本年度は、昨年度の結果をふまえて、電子顕微鏡の仕様を決定し、数多い改造を含め、実際に電子顕微鏡の製作を行った。実験としては、低電子線量法の改良と、クライオトランスファーの最適化のための真空系の見直しに特に重点を置いた。
実際の蛋白質結晶の観察にあたっては、氷包埋試料を用いるため、電子線損傷の最小化と、試料の汚染を防止することが極めて重要になる。低電子線量法では、電子線回折との有機的結合をはかるとともに、傾斜試料のために多点でフォーカスを合わせられるようにした。また、これまで目的とする領域に不必要な電子線が照射されるのを防ぐためには、ビームを振ることによって逃げていたが、電子銃のバイアス電圧や、フィラメント電流を変化させる方法も検討した。その結果、電子銃のバイアス電圧を変える方法が使え、ビームを振る方法よりも優れている可能性があることが判明した。一方、氷包埋試料の観察の最適化のために、クライオトランスファー時の霜の発生を防ぐシールドの開発を行うとともに、試料汚染防止装置の効果の検証、ドラッグポンプを用いた粗引真空系の最適化を図った。実際、配管材料等を見直すことにより、これまでよりも2ケタ良い真空度を得られることがわかった。このことは、フィルムから発生する水蒸気による試料の汚染を防ぐのに大きな効果があるはずである。
数多くの改良によって、蛋白質結晶の構造解析のために最適化された電子顕微鏡をつくりあげることが出来たが、電子線回折パターンの収集は、非常に限られた予算のために満足できる結果が得られたとは言い難い。

【研究種目】試験研究(A)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】43,000千円 (直接経費: 43,000千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】04454618 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋小胞体 / カルシウム / ATPase / 三次元構造解析 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 低温電子顕微鏡法 / カルシウムATPase / 三次元構造 / 構造変化 / 蛋白質結晶 / 画像解析

【研究成果の概要】

本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包理電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標とした。まず、ATPとカルシウムがともに結合していない状態のチューブ状結晶から14A分解能で三次元構造を解析し、Natureに発表した。この結果、膜内構造は3つのセグメントからなるユニークなものであることが判り、アミノ酸配列から予想される二次構造ともかなりの対応がつけられた。さらに、加水分解されないATPのアナログであるクロミウムATPを結合させた状態の構造を、やはり14A分解能で解いた。両者のチューブ状結晶においてらせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していたポケットが埋まり、そのすぐ上の領域が蓋のように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bセグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側まで伝わることが確かめられた。高濃度のカルシウイオン存在下で生成する三次元微結晶に関しては、10Aを越える分解能で、膜に沿った方向の像を得た。以上の研究によって、次の段階である時間分解構造解析の基礎を作ることができた。
一方、チューブ状結晶の歪みを補正するための一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適用したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,700千円 (直接経費: 6,700千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】03680228 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

三次元構造解析 / 膜蛋白質 / カルシウムATPase / 筋小胞体 / 低温電子顕微鏡法 / 氷包埋法 / 蛋白質結晶

【研究成果の概要】

本研究では,筋小胞体のカルシウムポンプである,カルシウムATPaseの三次元構造を,自然な脂質二重膜に埋まったままの状態で,氷包埋低温電子顕微鏡法を用いて,14Å分解能で求めた。(現在は,結晶化条件の検討によって,11Å分解能の顕微鏡像も得られている。)三次元像は,チュ-ブ状結晶のらせん対称性を利用し,本研究で改良したプログラムを用いて得た。らせんのパラメ-タはチュ-ブごとに異っていたが,私が開発した手法により,系統的指数付けを行い,3種の独立した平均デ-タを得た。得られた構造は,分解能の違いによる差はあるが,基本的に同一であった。これは,高等動物の膜蛋白質の3次元構造としては,現在得られている最も詳細なものである。最大の成果は,この分子の膜内の構造が初めて明らかになり,一次構造との対応もある程度つけられたことである。上記の分解能では個々のαらせんは解像できないが,膜内は,細胞質側とつながった主要部の他に,2つの細い(1〜2本の膜貫通らせんから成ると考えられる)部分から成っていた。そのうちの一つは膜に対して著しく傾斜しており,主要部と小胞体内側で結びつけられていた。アミノ酸配列からは一本だけ異常に長い膜貫通らせんの存在が予想されており,このらせんと主要部との間にのみ,比較的長いペプチド鎖の存在が予想されていた。従って,得られた三次元構造は,構造予測のモデルと非常に良く一致するものであった。この長い傾いたらせんと機能の関係は現在のところ解っていない。
一方,プログラムの開発も続けられており,格子の歪みを補正する新しいプログラムの開発を行った。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1991

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】03558028 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

閃光光分解 / 氷包埋法 / 低温電子顕微鏡法 / caged物質 / 時間分解 / 三次元構造 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / 氷胞埋法 / 三次元構造解析 / 急速凍結法

【研究成果の概要】

本研究は、生体反応に伴う生体高分子の構造変化を分子レベルで可視化すべく、氷包埋低温電子顕微鏡法とcaged化合物の閃光光分解を組み合わせた、新しい技術を開発しようというものである。時間分解能を得るために、試料を閃光照射による反応開始から適当な時間で急速凍結し、ガラス状の氷に試料を包埋したまま、染色・固定無しに低温で観察する。そして、電子顕微鏡像から三次元構造を再構成する。この研究は代表者が英国で行った予備的研究に基づくものであり、閃光照射に伴う熱発生を如何にして抑えるかが、技術上最大の問題であった。Caged物質の閃光光分解は他の分野で既に使われているが、熱の問題は、電子顕微鏡法に応用する際、特に大きな問題となる。それは、試料が支持膜上の非常に薄い溶液(氷)の層であり、支持膜は光分解に使われる近紫外の光に対し不透明であるためである。本研究では、光源にネオディミウム・ヤグレーザ、caged物質としてcaged-ATPを用いた。パルス・レーザーは、単色の光源として優れているが、パルス幅が数ナノ秒と短く、支持膜からグリッドへの熱伝導が殆ど起こらないため、熱の問題は予想よりも遥かに深刻であった。しかし、支持膜に銀を採用することで入射光の大部分を反射し、入射光をグリッドと平行に近くなるまで低い角度で照射することによって、著しく低減できた。この結果、試料である膜蛋白結晶の規則構造を保ちつつ、10%以上の変換効率でcaged物質を閃光光分解することができた。本研究によって、生体反応を可視化する道が開けたといえよう。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1991 - 1992

【配分額】8,400千円 (直接経費: 8,400千円)