Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

生物・生体工学 / バイオテクノロジー / タンパク質 / 多糖分解酵素 / 極限微生物 / 好アルカリ性細菌 / キシラン / キシラナーゼ / 触媒ドメイン / キシラン結合ドメイン / ファージディスプレイ / 進化分子工学 / タンパク質工学 / 反応至適pH

好アルカリ性バシラス属細菌41M-1株に由来するキシラナーゼ(多糖キシランの加水分解酵素)に注目し,その好アルカリ性機構および基質認識・識別機構の分子レベルでの解明と,反応至適pHならびに基質特異性の変換を目的として,以下の研究を実施した。
(1)触媒ドメインに存在する基質の認識・識別に関与するアミノ酸残基の特定
41M-1株キシラナーゼの触媒残基近傍にアミノ酸置換を導入した各種変異型酵素を調製し,その基質キシランとの相互作用を調べることにより,本酵素の基質認識・識別に関与する芳香族アミノ酸残基を特定することができた。
(2)触媒ドメインに存在する反応至適pHに関与するアミノ酸残基の特定
41M-1株キシラナーゼの触媒ドメインにある種のアミノ酸置換を導入することにより,反応至適pHが酸性側に大きくシフトすることがわかり,本酵素の好アルカリ性に関与するアミノ酸残基を明らかにすることができた。
(3)キシラン結合ドメインのキシラン認識機構の解明
41M-1株キシラナーゼのキシラン結合ドメインをコードする遺伝子にランダム変異を導入し,ファージディスプレイした後,キシランへの結合能を失ったファージを選抜した。キシランへの結合能を失ったキシラン結合ドメインにおける変異導入箇所を調べることにより,キシラン認識に関与するアミノ酸残基を特定することができた。また,41M-1株キシラナーゼのキシラン結合ドメインは,キシランを単糖レベルおよびオリゴ糖レベルの両方で認識・結合することを明らかにした。

極限環境微生物 / アルカリ酵素 / キシラナーゼ / 遺伝子クローニング / タンパク質工学 / 極限微生物 / アルカリキシラナーゼ

好アルカリ性バシラス属細菌41M-1株が生産するキシラナーゼの触媒機構やアルカリ性への適応機構を分子レベルで明らかにすることを目的として,遺伝子クローニングとタンパク質工学検討を行った.
(1)キシラナーゼ遺伝子のクローニングと解析
41M-1株染色体よりキシラナーゼ遺伝子をクローニングし,塩基配列決定を行った.本遺伝子には27アミノ酸のリーダー配列と327アミノ酸の成熟型酵素がコードされていた.他のキシラナーゼとのアミノ酸配列比較から,本酵素のN末端側2/3の領域は触媒ドメインと考えらた.その下流には,リンカー配列を介して,約100アミノ酸の機能未知領域がC末端側に伸びていた.
(2)触媒活性に関与するアミノ酸残基の特定
部位特異的変異により触媒ドメインにアミノ酸置換を導入した各種変異型酵素を調整し,野生型酵素との活性比較を行った.その結果,本酵素においては2つのGlu残基が触媒残基として機能していることが推察された.また,いくつかのTrpおよびTyr残基の活性への関与も示された.
(3)C末端機能未知領域の解析
部位特異的変異の手法を用い,本酵素のC末端側に存在するポリペプチド領域の欠失を行った.C末端欠失型酵素および野生型酵素の性質比較から,C末端領域は本酵素の触媒活性発現に必須ではなく,多糖への結合に関与していることが示唆された。