【研究領域課題番号】19H02519 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘモシアニン / 電子顕微鏡 / 構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / タンパク質包摂

【研究成果の概要】

種々のリンカーを介してゲストタンパク質をヘモシアニン内部に結合させることができた。また、リンカーの違いにより、ゲストの結合がホストの１０量体構造の維持に及ぼす影響が異なることがわかった。これは、ゲストがホスト内部に結合する強さに起因することが示唆された。電子顕微鏡観察からも、条件を整備することで、内部にゲストを包摂したまま安定な１０量体構造を維持できることがわかった。金ナノ粒子を用いた評価からは、ゲストの包摂率を向上させることの重要性が示唆された。

【研究の社会的意義】

著しい発展を遂げているクライオ電顕単粒子解析であるが、100 kDa以下の小さな蛋白質や形状に際立った特徴のない蛋白質の解析は依然として難しく、あらゆる蛋白質の構造を容易に決定できる手法の開発を望む声は大きい。ヘモシアニンをゲストに用い、その開発を目指した本研究で得られた知見、すなわち、ホストの会合構造がゲストを結合させるリンカーの種類により異なることや、ゲストの包摂率を向上させることの重要性が、今後の技術開発に寄与することが期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】構造・機能材料

【研究領域課題番号】17H01325 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

電子回折 / 電池用負極材料 / アモルファス / リバースモンテカルロ / 電池用負極材 / 局所構造 / 電池材料 / 構造解析 / 構造モデリング / 局所電子回折 / リバースモンテカルロ法 / 電池用材料 / 局所構造解析 / 電子顕微鏡 / アモルファス物質 / モデリング

【研究成果の概要】

本研究では、従来手掛けてきたオングストロームビーム電子回折実験に関連した新たな解析技術の開発を行い、リチウムイオン電池のアモルファス負極材の解析にこれらの技術も応用することで、これまでに得られなかったアモルファス電池材の局所構造の情報を得られるようになった。さらに、実際に充放電を行ったアモルファス材についても解析を行い、充放電過程における局所構造の情報を得られるようになった。今後、リチウムイオン電池の充放電機構解明のため、さらに微視的な詳細を得る予定である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】40,560千円 (直接経費: 31,200千円、間接経費: 9,360千円)

【研究分野】無機材料・物性

【研究領域課題番号】12F02783 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

grain boundary / electron microscopy / ceramics / 走査透過型電子顕微鏡 / セラミックス / 界面原子構造 / 構造解析

【研究成果の概要】

In this study, we fabricated a bicrystal, possessing bi-crystallographic relations of (310)[001]||(310)[001] between upper and lower crystals. Analysis of diffraction patterns confirms these orientations to within a small misfit tilt angle, and high-resolution TEM(HRTEM) reveals a perfect joining at atomic level. The HRTEM image of the grain boundary(GB) of the MgO bicrystal shows that MgO atoms were arranged symmetrically on the GB and the stronger bright spots are arranged periodically at intervals of 0.62 nm on the GB. Since this periodic arrangement of atoms is the very property of the Σ5 GB, we can　confirm that a Σ5 symmetric tilt GB is manufactured. In addition, from the HAADF (High-Angle-Annular-Dark-Field) and EELS (Electron Energy-Loss Spectroscopy) mapping images, the very small amount impurities of calcium (Ca) and titanium (Ti) atoms are segregated at the GB at the same time, and formed the ordered array at the atomic scale which was not present in the natural three-dimensional structure. According to the theoretical calculations, the defects and the charge were strongly combined and formed a complex stable structure. This structure results in a significant change in properties of the sintered material. The strongly bound grain boundary which has such a stable structure, will increase the strength of the bulk material. It was found that the trace amounts of impurities in the ceramic grain boundary will make the ordered superstructure self-assembled, and greatly affect the physical properties of the ceramics materials.

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】有機化学

【研究領域課題番号】18655012 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

有機化学 / 構造解析 / 電子顕微鏡 / カーボンナノチューブ / 構造決定法

【研究成果の概要】

1分子1分子をあたかも分子模型のように見ることは自然科学者の長年の夢である.本研究では,透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて孤立有機分子の原子像および化学反応を観察することで,全く新しい有機構造化学の橋頭堡を築くことを目的としている.前年度までに,有機分子一分子の形と運動の直接観察に世界で初めて成功している.本年度はさらに観察対象の幅を広げ,様々な分子の単分子構造観察と,その動的挙動の観察に挑戦した.
フラーレンとピレンをアミド結合で繋いだ分子をカーボンナノチューブに内包させてTEMにより観察したところ,ピレン部位が回転する様子を動画として捉えることに成功した.また,アミド基のコントラストを明確に確認することができ,電子顕微鏡による官能基レベルの構造同定が可能であることを示した.
さらに,炭化水素鎖がカーボンナノチューブ表面に存在する孔を通過する様子を観察することができた.フラーレンに炭化水素鎖を結合した分子をチューブに内包すると,時折炭化水素鎖がホーンの外へ突き出し,数秒の後にまた内部へと戻っていく様子が明瞭に観測された.膜を透過する分子の様子をとらえた例というのは過去にも例が無く,膜と分子の相互作用をみる新しい研究手法となりうることが期待される.
以上はカーボンナノチューブの中に閉じこめた分子の構造観察であるが,ナノチューブ表面上に結合した鎖状分子のより自由な動きを直接観察することも可能であることが明らかとなった.アミノ化カーボンナノチューブ上にビオチン部位を有するトリアミドを結合し,高分解能透過型顕微鏡観察を行った結果,ナノホーンの突端に結合したアミドの単分子像が得られた.画像のコントラスト解析により,複数のアミド分子に対してその立体配座を決定することができた.さらに,アミド分子の配座変換の様子を数分にわたる動画として記録することにも成功した.

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】09480171 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / 筋小胞体 / 能動輸送 / 三次元構造 / 電子顕微鏡 / 構造解析 / 膜蛋白質 / X線結晶解析

【研究成果の概要】

本研究では能動輸送の構造的基盤を解明するために、P型イオンポンプを代表する筋小胞体カルシウムATPaseを対象として、電子線・X線構造解析を行った。この膜蛋白質は本研究を開始した時点で、電子線で解析可能な2つの形態の結晶を作ることが知られていた。すなわち、カルシウムイオン非存在下小胞体膜そのものが変形してつくるチューブ状結晶と高濃度カルシウムイオン存在下で再構成膜がつくる三次元微結晶である。チューブ状結晶に関してはさらにATPの非加水分解アナログである。クロミウムATPを結合した状態でもチューブ状結晶をつくることを見出し、米国グループとの共同研究になる阻害剤thapsigarginを結合した状態とあわせるこの状態の構造を8A分解能で解析した。これによって膜内の二次構造やATPの結合部位が明らかになり、結果の一部分はNature,Biophys J に報告した。また、そのために広範なプログラムを開発した(投稿準備中)。一方、高濃度カルシウム存在下の三次元結晶の膜と平行な2回回転軸(b軸)方向の投影像を得、チューブ状結晶からの三次元構造と比較したところ、分子全体で大きな構造変化があることが判った(Biophys J に発表)。さらに、結晶化条件を改良した結果、薄いながらも良質の板状三次元結晶を得ることに成功した。ごく薄いものは電子線で、厚いものはX線で解析できることがわかった。電子線用の回転カメラと解析ソフトウェアを開発した結果、格子定数は電子線用のごく薄いものもX線結晶解析に用いたものとほぼ同一であることがわかった。そこで電子顕微鏡像による位相の収集に取り組み、部分的ではあるが大変有用な位相情報が得られた。現在、重原子同型置換体の探索を行っている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】13,800千円 (直接経費: 13,800千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】08044195 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / カルシウムポンプ / 能動輸送 / 三次元構造 / 電子顕微鏡 / 構造解析 / 膜蛋白質

【研究成果の概要】

本研究は、イオンポンプの輸送サイクルの幾つかの状態での三次元構造を電子線構造解析によって可視化する事により、イオンの能動輸送の構造的実体を明らかにしようとするものである。対象とした筋小胞体カルシウムATPaseは、筋肉の弛緩時にカルシウムイオンを汲み出すポンプである。能動輸送の実体の解明には生理的に異なった状態の構造を解明することが必須であるが、本研究では特に、カルシウムが存在しない時にできるチューブ状結晶の高分解能解析と高カルシウム濃度でできる三次元結晶の構造解析に重点をおいた。チューブ状結晶に関しては、高分解能化のためのソフトウェアを代表者側が開発し、CrATPを結合させたもの、thapsigarginの結合部位を結合させたものについて解析を行った。この結果、ATP結合位置の同定(Biophys.J.発表済み)と8Å分解能での解析に成功した。thapsigargin存在下のものに関しては、10本の膜貫通へリックスが解像できており、イオン通路と思われる孔もみえる(Nature印刷中)。これは、日本側のソフトウェアと米国側の新鋭電子顕微鏡とが組合わさって得られた結果である。この目的のために、日本側が2度、米国側が1度渡航した。三次元微結晶に関しては、まだ手法的にも未確立であり、とりあえず7Å分解能で構造を解くことが目標である。そのために、代表者と分担者(小川)が渡米し、具体的な方針について討論した。また、膜面に平行に見た像が9Å分解能で得られ、カルシウム非存在下の構造とは大きく異なっていることもわかった。これも、共同研究の成果としてまとめ、投稿中である。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】5,300千円 (直接経費: 5,300千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】05508004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

電子顕微鏡 / 蛋白質結晶 / 電子線回折 / 氷包埋法 / 構造解析 / 電子線損傷 / クライオトランスファー / 結晶解析 / 電子線回析 / 低電子線量法 / CCDカメラ / 電子線 / 三次元構造解析

【研究成果の概要】

本年度は、昨年度の結果をふまえて、電子顕微鏡の仕様を決定し、数多い改造を含め、実際に電子顕微鏡の製作を行った。実験としては、低電子線量法の改良と、クライオトランスファーの最適化のための真空系の見直しに特に重点を置いた。
実際の蛋白質結晶の観察にあたっては、氷包埋試料を用いるため、電子線損傷の最小化と、試料の汚染を防止することが極めて重要になる。低電子線量法では、電子線回折との有機的結合をはかるとともに、傾斜試料のために多点でフォーカスを合わせられるようにした。また、これまで目的とする領域に不必要な電子線が照射されるのを防ぐためには、ビームを振ることによって逃げていたが、電子銃のバイアス電圧や、フィラメント電流を変化させる方法も検討した。その結果、電子銃のバイアス電圧を変える方法が使え、ビームを振る方法よりも優れている可能性があることが判明した。一方、氷包埋試料の観察の最適化のために、クライオトランスファー時の霜の発生を防ぐシールドの開発を行うとともに、試料汚染防止装置の効果の検証、ドラッグポンプを用いた粗引真空系の最適化を図った。実際、配管材料等を見直すことにより、これまでよりも2ケタ良い真空度を得られることがわかった。このことは、フィルムから発生する水蒸気による試料の汚染を防ぐのに大きな効果があるはずである。
数多くの改良によって、蛋白質結晶の構造解析のために最適化された電子顕微鏡をつくりあげることが出来たが、電子線回折パターンの収集は、非常に限られた予算のために満足できる結果が得られたとは言い難い。

【研究種目】試験研究(A)

【研究期間】1993 - 1994

【配分額】43,000千円 (直接経費: 43,000千円)