Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

IRBIT / LongIRBIT / pH / 塩素イオン / Splicing variants / 多機能性蛋白質 / 神経可塑性 / カルシウム / splicing varinats / 神経科学

IRBITファミリーのpHおよび塩素イオン濃度制御に関与する新規相互分子を同定し、機能解析を行った。その結果、IRBITファミリーはAnion Exchanger 2/3およびAno1と相互作用し、その活性を制御することを明らかにした。IRBIT欠損神経細胞はpHおよび塩素イオン濃度変化に異常がある事がわかった。IRBITファミリーは様々な標的分子と結合する多機能性タンパク質であることから、IRBITファミリーの標的分子選択性に関して解析を行い、IRBITおよびLongIRBITのsplicing variantsは異なる発現分布、タンパク質安定性、標的分子親和性を示すことを明らかにした。

IRBITファミリーの標的分子選択機構の一つとして、スプライシングによる部分配列変化とヘテロ多量体形成の組み合わせによる多様性という新たな制御機構を示した。このことは、様々な分子と相互作用することで多様な生命現象に寄与する多機能性分子が、いかにして標的分子を選択し、適切な生命活動を担うのかという分子生物学の本質的問いに新たな知見を与えるものと考える。また、AEは原発性胆汁性肝硬変や尿生殖路の自己免疫疾患、QT短縮症候群や白内障との関連が報告されている。CaCCに関しては前頭洞癌との関連が報告されており、これら疾患の発症機序解明の新たな糸口となる可能性がある。

カルシウム / 不定胚 / ニンジン / 共焦点レーザー顕微鏡 / レーシオイメージング / pH / fluo-3 / Fura Red / レーシオイメージング法 / Fura red / 共焦点レーザ顕微鏡

ニンジン培養細胞塊および不定胚内のカルシウムイオン濃度を共焦点レーザー顕微鏡で観察するために、蛍光プローブとして、fluo-3とFra Redを用いたレーシオイメージング法を適用した。また、カルシウムイオン濃度観察の必要上、細胞塊および不定胚内のpHを,carboxy-SNARF-1をプローブとしたレーシオイメージング法により測定した。カルシウムイオン濃度とレーシオの関係のキャリブレーションはin vivoで行った。その結果、次の諸点が明らかとなった。
1.測定時の温度は培養時の温度と同一にしないと、カルシウムに関するレーシオが変化する。
2.培地のpHを変化させると、細胞内あるいは不定胚内のpHは変化しないが、カルシウムに関するレーシオは変化する。すなわち、観察には培養液をそのまま用いる必要がある。
3.不定胚誘導処理後、1日目を除いて、9日目までは、pHは6.8で一定であった。1日目は6.0と低い値であった。なお、10日目以降は、細胞が大きくなりすぎて、共焦点レーザー顕微鏡では観察できなかった。
4.カルシウムイオン濃度は不定胚誘導処理前は0.10μmolL^<-1>であったが、誘導開始後徐々に低下し、5から7日目ころに0.04μmolL<-1>以下となり、その後、球状胚が出現してくる9日目に急激に0.4μmolL^<-1>まで上昇した。
5.継体培養を繰り返し、不定胚形成能力を失った細胞塊のpHは、不定胚誘導開始前6.3、その後5.9で、7日目に6.4と、不定胚が誘導された場合に比べて低い値であった。カルシウムイオン濃度も、誘導開始後、0.04μmolL^<-1>以下と低い値であった。

キャッチ結合組織 / 粘度 / イオン環境 / カルシウム / pH / イオノフォア / アセチルコリン受容体

かたさの変わる結合組織(キャッチ結合組織)の粘度に対するイオンの影響を調べた。材料としてニセクロナマコHolothuria leucospilotaの体壁の真皮を用い、クリープ試験により伸び粘度を測定した。粘度はCa欠除海水(Ca-free)中では正常人工海水(ASW)中の1/10になる。Ca-freeにSrを加えると粘度は通常値まで回復したが、BaやMgでは回復しなかった。ASW中の他の陽イオン濃度を変化させた。Mg欠除ASW,高MgASW,Naをコリンで置換したASW,Naを庶糖で置換したASW*,高KASW,低pH ASW*,高pH ASWの各液は、いずれも粘度を増加させた。ただしCa-free中では*をつけた液以外では粘度増加効果は認められなかった。Caは細胞外高分子間の粘度を保つのに必要であるとともに、粘度を制御している神経分秘細胞の活動にも必須と思われる。MgやKは細胞の活動に影響し、低イオン強度や酸性の海水は直接細胞外高分子間の相互作用に影響していると思われる。そこで【Ca^(2+)】や【H^+】濃度が分泌細胞からイオンが分泌されて変わっている可能性があるため、Caイオノフォア(A23187)とHイオノフォア(tetrachlorosalicylanilide,モネンシン)(各【10^(-5)】M)の効果を調べた。A23187は無効だったが、HイオノフォアはCa存在下で粘度を5倍上昇させた。ただしCa-free中では効果は見られなかった。これより、【Ca^(2+)】や【H^+】が直接分泌されている可能性は低いと思われる。
キャッチ結合組織の神経制御について薬理学的な研究を行った。ナマコ体壁真皮にも、ウニ棘キャッチ靭帯にも、ニコチン様とムスカリン様の二種のアセチルコリン受容体の存在することがわかった。ナマコにおいてはムスカリン様受容体は粘度減少と関係し、ニコチン様受容体は粘度増加と減少の両方に関与していた。キャッチ靭帯においては、両受容体とも粘度増加に関与しており、粘度減少はアドレナリン受容体が関与していた。

【研究分担者】
荊木康臣	山口大学	農学部	助教授	(Kakenデータベース)
兼子敬子	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)
富士原和宏	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)