Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

進化工学 / バイオセンサー / 生合成 / イソプレノイド / アルカロイド / 合成生物学 / 進化分子工学 / 転写因子 / メタボライト / 安定性

進化分子工学 / カーボンニュートラル / 非侵襲的手法 / リアルタイム検出 / バイオセンサー / バイオエネルギー / 物質生産 / 生物発光 / リアルタイム / アルデヒド / 発光検出 / 細胞内アルデヒド生成量 / ハイスループットスクリーニング / 微生物による物質生産 / タンパク質 / 非侵襲的検出

微生物を用いた物質生産では、目的生成物の収量を最大化するために、遺伝子の種類、発現量、培地条件、培養温度など、数多くのパラメーターに関し、多くの実験を試行し、生産条件を決定（最適化）する。この最適化のプロセスが、物質生産の実用化プロセスの律速段階となっている。本研究では、標的物質、もしくはその前駆体となる物質（目的物質）の生成に応じて発光する大腸菌（バイオセンサー大腸菌）を開発し、大腸菌で目的物質の生成を行い、律速段階とある反応（酵素）について、バイオセンサー大腸菌を用いた進化分子工学により、その高活性化を実現し、目的物質（もしくはその前駆体）を高生産する大腸菌の開発を行う。
本研究では、昨年に引き続き、目的物質を生成する人工遺伝子回路の設計とその構築の準備を進めてきた。人工遺伝子回路の設計はおおよそ完了している。目的物質類縁体に対して、バイオセンサータンパク質が反応することが明らかとなった。バイオセンサーとしては、選択性と感度の改良が必要であるため、その準備を進めている。さらに、新型コロナウイルスの感染状況の悪化や、感染予防措置による時短、また、研究室の立ち上げに時間を要し、実現には至っていない。
この他に、白血病の原因となるタンパク間相互作用を阻害するペプチド断片を設計し、野生型ペプチドよりも高い結合能で阻害することを確認し原著論文として発表した。また、バイオ燃料として期待されるアルカン（軽油相当）を生成する２つのタンパク質に関するこれまでの研究について総説として発表した。

進化分子工学 / タンパク質工学 / 遺伝子工学 / バイオセンサー

本年度は,エストロゲンレセプターの分子結合部位を含むドメインをアルカリホスファターゼに挿入した融合タンパク質の機能・構造解析を行った.それらの遺伝子にランダム変異を導入し,エストロゲン様物質に対するセンサータンパク質のスクリーニングを行った.
(1)挿入型融合タンパク質の発現・精製および機能・構造解析
前年度に構築した10種類の挿入型融合タンパク質,すなわち,アルカリホスファターゼの立体構造上表面に位置する5つの部位(アミノ酸残基番号:189,250,315,360,408)に,2ないし11アミノ酸残基の2通りのリンカーを介して,エストロゲンレセプターを挿入したタンパク質を,それぞれ大腸菌内で発現したところ,すべて不溶性画分に存在した.それらを変性条件下で精製し巻き戻したタンパク質について,エストラジオール存在下および非存在下でホスファターゼ活性を測定したところ,すべて活性は検出できなかった.それらの円二色性測定を行ったところ,二次構造含量がかなり低下していたことから,タンパク質の巻き戻しが不十分であることが示唆された.
(2)センサータンパク質のスクリーニング
そこで,上記10種類の融合タンパク質にランダム変異を導入して,前年度に用意した,PVDF膜を用いたスクリーニング系を用いて,エストラジオール存在下でホスファターゼ活性を示すコロニーのスクリーニングを試みた.ランダム点変異の導入は,Error-prone PCR法で行った.このPCR産物を制限酵素で消化してベクターに連結し,挿入型融合タンパク質の変異体遺伝子ライブラリーを作製した.このライブラリーを大腸菌に導入したコロニーをPVDF膜に転写し,ホスファターゼ活性を示すコロニーをスクリーニングした.しかし,選択されたコロニーの活性は宿主由来のものばかりで,目的の変異体を得ることはできなかった.現在,スクリーニング系の改良を行っている.