Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

筋小胞体 / カルシウム / ATPase / 三次元構造解析 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 低温電子顕微鏡法 / カルシウムATPase / 三次元構造 / 構造変化 / 蛋白質結晶 / 画像解析

本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包理電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標とした。まず、ATPとカルシウムがともに結合していない状態のチューブ状結晶から14A分解能で三次元構造を解析し、Natureに発表した。この結果、膜内構造は3つのセグメントからなるユニークなものであることが判り、アミノ酸配列から予想される二次構造ともかなりの対応がつけられた。さらに、加水分解されないATPのアナログであるクロミウムATPを結合させた状態の構造を、やはり14A分解能で解いた。両者のチューブ状結晶においてらせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していたポケットが埋まり、そのすぐ上の領域が蓋のように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bセグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側まで伝わることが確かめられた。高濃度のカルシウイオン存在下で生成する三次元微結晶に関しては、10Aを越える分解能で、膜に沿った方向の像を得た。以上の研究によって、次の段階である時間分解構造解析の基礎を作ることができた。
一方、チューブ状結晶の歪みを補正するための一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適用したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。

閃光光分解 / 氷包埋法 / 低温電子顕微鏡法 / caged物質 / 時間分解 / 三次元構造 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / 氷胞埋法 / 三次元構造解析 / 急速凍結法

本研究は、生体反応に伴う生体高分子の構造変化を分子レベルで可視化すべく、氷包埋低温電子顕微鏡法とcaged化合物の閃光光分解を組み合わせた、新しい技術を開発しようというものである。時間分解能を得るために、試料を閃光照射による反応開始から適当な時間で急速凍結し、ガラス状の氷に試料を包埋したまま、染色・固定無しに低温で観察する。そして、電子顕微鏡像から三次元構造を再構成する。この研究は代表者が英国で行った予備的研究に基づくものであり、閃光照射に伴う熱発生を如何にして抑えるかが、技術上最大の問題であった。Caged物質の閃光光分解は他の分野で既に使われているが、熱の問題は、電子顕微鏡法に応用する際、特に大きな問題となる。それは、試料が支持膜上の非常に薄い溶液(氷)の層であり、支持膜は光分解に使われる近紫外の光に対し不透明であるためである。本研究では、光源にネオディミウム・ヤグレーザ、caged物質としてcaged-ATPを用いた。パルス・レーザーは、単色の光源として優れているが、パルス幅が数ナノ秒と短く、支持膜からグリッドへの熱伝導が殆ど起こらないため、熱の問題は予想よりも遥かに深刻であった。しかし、支持膜に銀を採用することで入射光の大部分を反射し、入射光をグリッドと平行に近くなるまで低い角度で照射することによって、著しく低減できた。この結果、試料である膜蛋白結晶の規則構造を保ちつつ、10%以上の変換効率でcaged物質を閃光光分解することができた。本研究によって、生体反応を可視化する道が開けたといえよう。

【研究分担者】
奥富昭次	日本電子エンジニアリング	機器開発部	部長取締役