【研究分野】ケミカルバイオロジー

【研究領域課題番号】16K21060 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生物発光共鳴エネルギー移動 / 抗体 / 蛍光 / 発光プローブ / 直交性反応 / 非天然アミノ酸 / 無細胞タンパク質合成系 / 人工タンパク質 / ルシフェラーゼ / クリック反応 / 発光 / 蛍光消光 / バイオ直交性反応 / 生物発光プローブ / バイオテクノロジー / 生体分子計測 / 免疫測定

【研究成果の概要】

ルシフェラーゼ及びSNAP-tagを融合した一本鎖抗体scFvタンパク質をSNAP-ligandで部位特異的に蛍光標識することにより、抗原に応答して発光スペクトルの変化する新規生物発光プローブを開発することができた。また、市販のモノクローナルIgG抗体のN末端アミノ基及び糖鎖をそれぞれ位置選択的に標識する多重標識技術を確立した。さらに、予定外の成果として、ルシフェラーゼタンパク質に蛍光アミノ酸を部位特異的導入することで、発光極大を長波長側にシフトさせた人工発光タンパク質が得られた。

【研究の社会的意義】

位置選択的修飾技術を用いて抗体を蛍光標識することにより、抗体を蛍光・発光プローブへと変換する道筋が見えてきた。抗体を位置選択的に（多重）標識する技術は蛍光標識する以外にも用いることができるため、異なる機能を複数併せ持つ人工抗体の作製なども可能である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】24360336 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

antibody / fluorescence quenching / immunoassay / cell-free translation / biochip / protein engineering / chemical biology / bioimaging / バイオテクノロジー / バイオセンサー / イメージング / 抗体工学 / 細胞分化 / 免疫測定 / 蛍光エネルギー移動 / 蛍光消光 / バイオイメージング / バイオチップ / 臨床診断

【研究成果の概要】

我々が最近開発した，部位特異的に蛍光修飾した組換え抗体断片を使って各種抗原検出を高感度かつその場で迅速に行うことができる，新規免疫測定素子Quenchbody (Q-body)の基礎原理の確立と，各種の応用を目的として検討を行った。
従来の無細胞系に加えて細胞系でのFab型Q-body合成に成功し，これらを用いて新規な色素の発見，新規な修飾部位の発見，GFP変異体を用いた遺伝子にコードされたQ-body構築原理の発見，ビーズを用いたアッセイの成功，細胞分泌ペプチドの顕微可視化の成功，抗体以外のタンパク質を用いた同様の検出素子(Q'-body)の構築の成功，といった成果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】19,500千円 (直接経費: 15,000千円、間接経費: 4,500千円)

【研究分野】生物・生体工学

【研究領域課題番号】14350430 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ファージディスプレイ / 抗体 / 免疫測定 / オープンサンドイッチ法 / 低分子 / 単価抗原 / ペプチド / 無細胞タンパク質合成系 / 小分子 / 植物ホルモン / 蛋白質間相互作用 / ビスフェノールA / ターミネーター / アルカリフォスファターゼ / ビオチン

【研究成果の概要】

1.繊維状ファージを用いた新規な蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムの確立
ファージに二種類の蛋白質の片方のみを提示し,片方を分泌型蛋白質として産生させ両者の間の相互作用を測定することができる新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを構築した.これを各種の抗体可変領域VH/VL間の相互作用測定に応用したところ,モデル系で抗原添加に伴う相互作用変化を測定できた(オープンサンドイッチ法,OS法).さらにこのシステムでは二つのドメインVH, VL両者を同時に提示して抗原でパニングすることも可能であり,実際にフレームワーク領域のライブラリを作製し,これまで不明であった抗原結合能とVH/VL相互作用の強弱との関係,およびVH/VL間の相互作用を決定づける残基を明らかにした。
2.低分子の非競合的免疫測定法としてのOS法の確立
上記のSpFvシステムを用いて,各種低分子(ビスフェノールA,11-デオキシコルチゾール,ホスホチロシン,ジベレリンA24,オステオカルシンペプチド等)に対する抗体遺伝子クローニングと,OS法による非競争的免疫測定に成功した。いずれの抗原検出においても従来の競合法に比べ,高い検出感度と広い測定濃度域を得ることができた。また得られた遺伝子を用いてVHとアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質,およびMBP-VL融合蛋白質等の精製蛋白質を作製し,これらを用いて実用的な測定系を組むことができた。
3.真核細胞を用いた抗原特異的抗体発現細胞選択系の開発
抗原を認識して活性化し,増殖信号を伝達できる細胞表面キメラ受容体を発現させたIL-3依存性細胞株を用いて,抗原特異的な抗体断片を選択し,かつ細胞にCre recombinaseを発現させることで培養上清に糖鎖修飾scFvを分泌できるシステム(ASAPシステム)を構築した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】12,000千円 (直接経費: 12,000千円)