Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

酵素反応 / 環境技術 / 二酸化炭素 / 超臨界流体 / 不斉合成 / 超臨界二酸化炭素 / アルコール脱水素酵素 / 光学活性アルコール / グリーンケミストリー / デラセミ化 / 生体触媒 / Geotrichum candidum

デラセミ化反応は、ラセミ体の化合物を光学活性体へ変換する反応である。光学活性化合物は医薬品中間体として必要で、それらを環境に負荷をかけずに合成する方法は非常に重要であり、原子収率が100%であるデラセミ化反応の開発は急務である。そこで、本研究では、アルコール脱水素酵素によりデラセミ化反応を行う方法の開発を行った。溶媒としては、酵素反応では通常、水が用いられることが多い。しかし、水中での反応では、生成物の抽出が困難であったり、有機溶媒を使用したりすることが必要であるので、本研究では、超臨界二酸化炭素を溶媒として利用した。超臨界二酸化炭素は、抽出溶媒としては実用プロセスに用いられており、生体触媒反応のための溶媒としても、注目されている。本年度は、超臨界二酸化炭素中でのデラセミ化反応により、光学活性体の大量合成を行うために、超臨界二酸化炭素流通式装置の構築、酵素の大量発現、固定化、実用化に向けた検討を行った。その結果、超臨界二酸化炭素流通式装置を用いる生体触媒による物質変換に適した生体触媒の固定化法を見いだすことが出来た。また、超臨界二酸化炭素中での反応の実用化には、時間および体積あたりの収率が非常に重要である。そのためには、高活性な生体触媒が必要である。酵素を大量発現するためには、生化学的性質の解明する必要であるが、本研究で使用している酵素は、その単離精製が非常に困難である。そこで、本研究では、酵素を単離精製せずに、酵素の遺伝子を抽出し、酵素を大腸菌で大量発現させることを試みた。
以上の研究を行い、これらの結果により、超臨界二酸化炭素中でのデラセミ化反応の研究が進み、持続的社会の構築に貢献できた。

超臨界二酸化炭素 / アルコール脱水素酵素 / チチカビ / 不斉還元 / 光学活性アルコール / 置換基効果 / 生体触媒 / 吸水性ポリマー / フッ素化アルコール

本研究は、環境にやさしい高選択的な物質変換法を開発することを目的として行っている。具体的には、チチカビ(IF04597,IF05767等)による不斉還元反応の媒体として超臨界二酸化炭素を用い、光学活性アルコールの高効率的合成法の開発をめざす。平成12年度にはに吸水性ポリマー上に固定化したチチカビを用い、o-Fluoroacetophenoneの還元を行うと、超臨界二酸化炭素中において反応が進行することを見い出している。基質特異性を調べるために、様々な位置にハロゲン置換されているアセトフェノン誘導体を用い反応を行ったところ、置換基は不斉収率には、ほとんど影響しなかったが、収率は、o>m>pの順番に減少した。
また、保存性が悪い生菌体ではなく、乾燥菌体を用いた反応の検討を行った。水中の反応では、生菌体を用いるよりも効率が良いことが知られているが、超臨界流体中では、生菌体を用いた方が効率が良かった。さらに、生菌体を用いると高価な補酵素(NAD^+もしくはNADP^+)を加える必要がないが、乾燥菌体においては補酵素添加の必要があり、乾燥菌体よりも生菌体の方が超臨界二酸化炭素中の反応には適していることを見い出した。また、本研究により開発された、菌体そのものを超臨界流体中で用いた反応を行う技術は、アルコール脱水素酵素以外の酵素にも応用可能であることを見い出した。っまり、加水分解酵素のような安定性が高い酵素のみでなく、安定性が低い酵素でも超臨界二酸化炭素中で使用できることが判明し、環境に優しく、高効率的、実用的な超臨界流体中での生体触媒反応の可能性を大いに高めたと考えられる。

電気制御培養 / インテリジェントバイオリアクター / モノクローナル抗体 / CEA / タンパク質生産 / MKN45 / ハイブリドーマ / カーボン繊維 / スポンジ状カーボン / 生体触媒 / 酵素活性の電気制御 / 電気制御発酵 / 導電性高分子 / アルコ-ル脱水素酵素 / 酵母

本研究は、研究代表者らの創案による生体触媒活性の電気制御法を利用した「電気制御可能なインテリジェントバイオリアクター」を開発することを目的として行われた。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は浮遊培養に適しているため、ハイブリドーマ細胞の連続フロー型バイオリアクターを構築することは非常に困難である。本研究ではハイブリドーマ細胞を、導電性のカーボンメッシュ担体に細胞活性を保持した状態で固定化することに成功し、固定化細胞に直接電気印加を行うことを可能とした。さらに固定化ハイブリドーマ細胞を組み込んだフロー型リアクターを設計・試作し、浮遊細胞についても連続フロー方式の培養が可能であり、しかも細胞増殖および抗体産生を電気制御できることを明らかにした。また、このリアクターを用いてハイブリドーマ細胞にパルス電位を印加して電気制御培養を行うと、抗体産生能を向上できることが明らかとなり、その最適条件を見い出すことができた。
上記リアクターを(a)バッチ、(b)フロー、(c)バッチフロー、(d)培地供給型フローの以上4方式で電気制御培養を行い、それぞれのリアクターにおける細胞の増殖と抗体産生能を評価した。その結果すべての系で電気効果による抗体産生能を向上できるが、培地供給型フロー方式における抗体産生能の向上がもっとも顕著であった。
次いで、付着性細胞についてもフロー型バイオリアクターを適用し、電気制御培養によるタンパク質産生を行った。付着性細胞としてヒトガン由来の株化細胞MKN45を選択し、ガン胎児性抗原(CEA)の産生挙動を検討し電気効果によるCEA産生量の向上が起こることを見出した。また、タンパク質合成の阻害実験の結果から、この系に於ける電気効果がタンパク質分泌輸送の促進に寄与していることを示唆するに至った。
以上の結果から明らかなように、細胞機能を電気制御できるインテリジェントバイオリアクターを構築し、その基本特性を解明することができた。

【研究分担者】
森岡聡	三菱化成(株)	総研プロセス開発室	部長研究員
小畠英理	東京工業大学	生命理工学部	助手	(Kakenデータベース)
碇山義人	東京工業大学	生命理工学部	助教授	(Kakenデータベース)
森岡聰	三菱化成(株)総合研究所	部長研究員